徐莎莎1，张锐2，王倩1，陈晓卫1，朱天生1，陈小飞1*
（1塔里木大学农学院，
新疆阿拉尔843300；2塔里木大学园艺与林学学院，
新疆阿拉尔843300）
摘要：为有效控制喀什地区核桃腐烂病的发生与发展，采用形态学结合多基因分子鉴定技术，对新疆喀什地区核桃腐烂病病原
进行了鉴定。2020年，从喀什地区采集到核桃腐烂病病害样本，通过常规组织分离法分离后，获得17株真菌菌株，基于病原菌形态
学鉴定，采用ITS 、TUB 、ACT 3个基因片段对菌株基因组进行PCR 扩增。经过序列比对，结合菌株形态特征，
将喀什地区核桃腐烂病病原鉴定为。关键词：喀什地区；核桃；核桃腐烂病；病原鉴定；ITS
同等大小的菌饼置于孔中，以无菌培养基为对照，用保鲜膜包裹置于托盘中保湿培养。每个菌株接种5根枝条，重复3次。记录枝条每日的发病情况，并对发病后的枝条进行再分离。1.3病原菌的分子鉴定
用Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取病原菌基因组DNA 。以此基因组为模板PCR 扩增转录间隔区（in-ternal transcribed space ，ITS ）、β-微管蛋白（β-tubu-lin ，TUB ）、肌动蛋白基因（actin gene ，ACT ）3个基因片段，引物序列信息如表1所示。
核桃（）是胡桃科胡桃属植物，是世界四大干果之一，营养价值丰富，是与动物蛋白相当的优质蛋白[1]。核桃果实可以食用，树干可用于制作家具，是一种工艺价值和经济价值非常高的树种[2]。由于地理因素，新疆的大部分地区包括喀什地区在内，气候干燥，昼夜温差大，这样的条件为核桃的生长提供了良好新疆干果
环境[3]。随着核桃种植规模的不断扩大，
核桃生产上的病虫害问题也逐渐凸显，其中核桃树腐烂病是为害核桃产业健康发展的最大障碍[4]。喀什地区作为新疆核桃的主要产区，同样也是腐烂病普发区，严重影响当地经济社会发展。
为了科学地运用防治技术防控病害的发生与蔓延，本研究通过形态学与分子生物学技术，对采自喀什地区的核桃腐烂病病害样本进行病原鉴定，以期为核桃腐烂病的科学防控提供理论依据。
1材料和方法
1.1
病原菌的分离、
纯化与保存试验样本采自喀什地区（麦盖提县14份、疏勒县6份、巴楚县6份、叶城县1份），采用常规组织分离法[5]分离病原菌。将病害样品切成5mm ×5mm 的小块，经75%酒精浸泡30s ，次氯酸钠浸泡1min 后置入PDA （马铃薯200g 、琼脂20g 、葡萄糖20g 、蒸馏水1000mL ）培养皿中，于28℃全光照培养箱中培养。待长出菌落后，用灭菌挑针挑取菌落边缘菌丝进行菌株纯化，菌落长至距培养皿边缘约1cm 时，用直径为5mm 的打孔器打菌饼，置于冻存管中加入甘油-20℃保存备用。1.2致病性测定
在实验室进行离体枝条接种[6]，取1年生核桃枝
条，每段截为13cm ，用清水清洗枝条，
晾干后用酒精棉球对枝条进行表面消毒，
无菌水清洗3遍后晾干。用石蜡封住枝条两端并覆盖保鲜膜用于锁水。用直径为
7mm 的打孔器在枝条中央打孔，深度超过韧皮部，
将基金项目：塔里木大学研究生科研创新项目项目“核桃腐烂病的致
病因分析及病原菌遗传多样性分析”（TDGRI202018）。
第一作者：徐莎莎（1995-），女，在读硕士，
研究方向：植物病理学。通信作者：陈小飞（1978-），男，硕士，副教授，研究方向：植物病理学。
表1
供试PCR 扩增引物序列
基因片段
引物引物序列
ITS [7]ITS1TCC GTA GGT GAA CCT GCG G ITS4TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC TUB [8]Bt-1a TTC CCC CGT CTC CAC TTC TTC ATG Bt-1b GAC GAG ATC GTT CAT GTT GAA CTC ACT [9]
ACT512F AT GTG CAA GGC CGG TTT CGC ACT783R
TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT
表2
不同基因片段的PCR 反应程序
基因片段和引物
反应程序温度时间循环
ITS （ITS1/ITS4）
预变性94℃5min 35
变性
94℃30s 退火56℃30s 延伸72℃30s 终延伸72℃10min 保存4℃永久TUB （Bt-1a/Bt-1b ）
预变性94℃5min 35
变性
94℃30s 退火62℃30s 延伸72℃30s 终延伸72℃10min 保存4℃永久Tef-1α
（EF1-512F/EF1-783R ）
预变性94℃5min 35
变性
94℃30s 退火55℃30s 延伸72℃30s 终延伸72℃10min 保存
4℃
永久
现代园艺2022年第11期
7
4〇
PCR 反应扩增体系为2X SanTaq PCR Mix 10μL ，Primer1（10μmol/μL ）1μL ，Primer1（10μmol/μL ）1μL ，DNA 模板1μL ，加ddH 2O 补足至25μL 。扩增条件如表2所示，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像系统观察记录凝胶电泳结果，并将PCR 反应产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序。最后将所测得的基因序列通过与美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotech-nology Information ，NCBI ）数据库进行比对。用MEGAX 软件进行比对并构建系统发育树。
2结果与分析2.1
病害症状的观察
调查发现，核桃腐烂病在喀什地区一年有2次扩展高峰，从4月开始扩展速度逐渐加快，5月达到第1
次高峰，此后6－7月病斑扩展速度减慢，随着秋季的
到来，9月出现第2次高峰，10月之后至翌年3月，病斑处于休止状态。
从染病树皮能看到明显的小凸起，并伴随有橘黄卷须状菌丝吐出。大枝或主干症状表现为湿腐型，小枝或侧枝通常表现为枝枯型
（如图1所示）
。通过对喀什地区的9个园区的调查发现，喀什地区的核桃腐烂病发病率从0~36%不等，平均发病率为17.48%，病情指数为5.32。其中麦盖提园区1发病率最高达到36%，病情指数为12。根据调查，虽有部分园
区未见发病，但大部分园区都存在发病情况，
因而核桃腐烂病在喀什地区发生也较为普遍。2.2致病性测定
致病性测定试验表明，接种枝条2d 后打孔部位开始出现侵染症状，树皮变黄，7d 后枝条全部发病，出现黄水渍状病斑，15d 后长出黑分生孢子器，并在不久后吐出橘黄菌丝，对照组枝条不发病。离体枝条病健交界明显，呈褐或
黑，并伴随组织萎蔫，
对发病组织进行病原菌分离，获得病原菌与原接种
菌在形态上呈现一致，
如图2所示。2.3病原菌形态学鉴定
从采集到的核桃腐烂病树皮样本中分离出27个分离物，纯化后的27株真菌菌落形态特征相同。菌落在培养基上性状表现为菌落致密，菌落形状近似圆形生长，菌落颜为米黄和橘红，子实体多数较大且稀疏，也有少部分为少且密集。1~3d 正面为白，背
面
A ：核桃腐烂病田间症状；
B ：
显微镜下的橘黄卷须状菌丝
图1核桃腐烂病形态为黄，3d 之后，
正面白菌丝，
菌丝稠密，
背面变为黄或橘黄，7d 左右产出子实体。分生孢子器由多个内陷的小腔室组成，分生孢子的形态为透明状、腊肠形（如图3）。根据形态特征鉴定为。2.4分子生物学鉴定
从麦盖提县、疏勒县、
巴楚县、叶城县分别选1株代表菌株（BC-1-P1、KS-1-P2、MGT-1-P1）提取基因组DNA ，分别扩增ITS 、TUB 、ACT 基因，均得到了与目的基因大小一致的凝胶电泳条带。将扩增产物测序后提交Genbank 并获得各基因登录号（ITS ：OK626647、OK626648、OK626649；TUB:OK662388、OK662389、OK662390；ACT ：OL310096、OL310097、OL310098）。序列Blast 比对结果表明，ITS 与 C.chrysosperma （KC880155.1）一致率达99.19%；TUB 与C.chrysosper-ma （MG971758.1）一致率达98.88%；ACT 与C.
chrysosperma （KF765722.1）一致率达98.65%。因此，
根据形态学鉴定结合分子鉴定结果表明，
中国新疆喀什地区侵染核桃树造成核桃腐烂病的病原为C.
chrysosperma 。通过MEGAX 进行系统发育分析，
选择10株代表菌株通过NJ 法构建系统发育树，代表菌株和无性型C.chrysosperma 及有性型Valsa sordida 聚在一起相似性较高（如图4）。
A ：处理组枝条；
B ：对照组枝条。
图2致病性测定结果A ：培养基上菌落正反面；B ：培养基上孢子
形态；C ：分生孢子器横切面；D ：分生孢子器纵切面；E ：分生孢子形态；F：菌丝形态。
图3 C.chrysosperma 形态特
征图4代表菌株基于ITS 序列构建的系统发育建树
3
讨论
核桃腐烂病为害部位主要是核桃树的树干、
枝条、根茎或裸露的根部[10]。受害果树树势衰弱，严重时整树死亡，最终导致减产甚至毁园。国内对核桃腐烂病相关研究主要集中在病害发生规律、发病因子、防
控技术，以及病原鉴定等方面。
张海军等[10]对山西阳
泉2022年第11期现代园艺7
5〇
（上接第73页）素是一种高效低毒的杀虫杀螨剂，具有广阔的发展前景。且天维菌素对水生生物毒性较低，有效地弥补了阿维菌素、伊维菌素等一些缺点。但目前天维菌素的普及尚处在初步阶段，需要进行大量的田间实验和与其他常用试剂的复配试验。
（收稿:2021-10-09）
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市核桃腐烂病病原菌进行鉴定，并将病原鉴定为茎点
霉属。在新疆，
郭开发等[11]通过形态学和分子生物学技术鉴定了阿克苏地区阿拉尔市、库尔勒市和三团的核桃腐烂病病原，明确病原为
。zhao 等[12]将新疆天山山脉地区核桃腐烂
病鉴定为。杜琴等[13]对新疆主要林木腐烂病菌种类进行了鉴定，发现新疆巴州核桃腐烂病系
由
侵染而引发。喀什地区是新疆核桃的主要产区之一，同时也是腐烂病的普发区。然而针对该地区核桃腐烂病病原菌鉴定的研究鲜有报道。本研究采用形态学结合分子生物学技术对喀什地区核桃腐烂病病原进行了鉴定，明确了病原的分类地位，为病害的科学防控打下了理论基础。然而病原鉴定只是科学开展病害防控的最基本
工作，为有效控制核桃腐烂病的发生与发展，
还需对喀什地区病害发生规律、影响因子及当地现有防控技术水平开展深入研究，从而精准施策以达到农药减量控害的目的。
4
结语
从新疆喀什多个地区采集的核桃腐烂病样品，分离得到27株致病真菌，分离物经柯赫式法则验证后，经形态学鉴定及分子鉴定，明确新疆喀什地区核桃树腐烂病病原菌为。病原菌分类地位的确立为科学开展病害综合防控，以及进一步深入研究病原菌打下
了基础。（收稿：2022-02-08）参考文献：
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