分子鉴定及表达分析
张雪梅1，李
婷1，涂
洋1，兰秀锦1，龚江洪2，唐力为3，马
建1*
（1.四川农业大学小麦研究所，成都
611130；2.四川省乐至县农业农村局农技站，四川乐至
641500；
3.攀枝花市农林科学研究院，四川攀枝花617061）
摘要:【目的】分析水稻中OsRAA1在小麦中的同源基因TaRAA1的结构、进化、启动子调控区域、组织特
异性表达以及非生物胁迫表达等，初步探索其在小麦中的生物学功能，为进一步遗传转化研究其功能提供指导。【方法】利用在线数据库获得TaRAA1的基因编码序列和蛋白结构，进一步分析其进化和表达模式，最后在“中国春”中进行RT-qPCR 验证该基因的组织特异性表达以及非生物胁迫表达。【结果】TaRAA1被定位到小麦第三同源染体（3A 、3B 和3D ），在所有分析物种中均无内含子，其基因结构具有高度保守性。在所研究的物种中除在水稻中检测到一个低复杂区域外，其他物种中均未检测到任何功能域。组织特异性表达分析表明，TaRAA1基因主要在小麦的根部大量表达。公共数据库和RT-qPCR 分析结果都表明小麦TaRAA1在高温、高盐、干旱处理下，表达量受到正向调控；而在低温和PEG 处理下，表达受到负向调控。【结论】TaRAA1基因可能在小麦受到非生物逆境胁迫时发挥着重要作用。关键词：普通小麦；TaRAA1；根发育；非生物胁迫；表达分析中图分类号:S512.1；S33
文献标志码:Ａ
文章编号:1000-2650（2020）06-0645-09张雅玫
Molecular Identification and Expression Analysis of A Root-Related
Ortholog of Rice in Common Wheat
ZHANG Xuemei 1，LI Ting 1，TU Yang 1，LAN Xiujin 1，GONG Jianghong 2，TANG Liwei 3，MA Jian 1*
（1.Triticeae Research Institute ，Sichuan Agricultural University ，Chengdu 611130，China ；2.Agro-technical station in Bureau of Agriculture and Rural Affairs ，Lezhi 641500，Sichuan ，China ；3.Panzhihua Academy of Agricultural and Forestry Sciences ，Panzhihua 617061，Sichuan ，China ）
Abstract:【Objective 】The structure ，evolution ，promoter regulatory region ，tissue-specific expression
and abiotic stress expression of the root-related ortholog of rice TaRAA1in wheat were analyzed to explore
its possible biological roles aiming at laying a foundation for further studying its function through genetic transformation.【Method 】The gene coding sequence and protein structure of TaRAA 1were obtained using a public database.The evolution ，expression pattern ，tissue-specific expression ，and abiotic stress ex -pression were further analyzed using public data combined with RT-qPCR in ‘Chinese Spring ’wheat.【Result 】TaRA A1was mapped to the third chromosome (3A ，3B and 3D)of wheat.Its gene structure was highly conserved among various species.In the researched species ，except for a low complex region detected in rice ，no functional domain was detected in other species.
The analysis of tissue-specific ex -pression showed that the TaRA A1gene was mainly expressed in wheat roots.The expression results from the public database and RT-qPCR showed that the expression of TaRAA 1was positively up-regulated under high temperature ，high salt and drought ，but down-regulated under low temperature and PEG.
第38卷第6期2020年12月
收稿日期:2020-08-05
基金项目：四川省应用基础研究计划项目（2020YJ0140和21YYJC1556）；四川省国际合作交流项目（21GJHZ0157）。作者简介：张雪梅，硕士研究生。*责任作者：马建，博士，教授，主要从事小麦产量性状基因的定位、分离、功能分析及其育种应用等研究，E-mail ：**************** 。
Vol.38
No.6
Dec .2020
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Agricultural University
第38卷
四川农业大学学报
【Conclusion】TaRAA1may play an important role in wheat under abiotic stress providing a clue for fur-ther analysis of its function through genetic transformation.
Keywords：common wheat；TaRA A1；root development；abiotic stress；expression analysis
小麦是全球种植面积最大的粮食作物，占全球作物种植面积的四分之一[1]。因此，小麦的产量会直接影响全球经济，收成失败可能导致社会动荡。在保证产量和适应区域特定生态环境的同时，育种工作者不断通过微调控制重要农艺性状的基因影响作物产量和最终使用质量等参数来培育改良品种[2-3]。
根系作为植物重要的营养器官，具有吸收利用水分和矿质元素，固定植株和保证植物正常生长的作用[4]，了解植物根系生长发育的分子机制，有助于提高作物根系性状和资源利用效率。因此根系性状的遗传改良对植株的发育以及产量的提高具有重要意义[5-7]。此外，优化根系系统还能够减少对氮肥等营养元素的需求，对环境和经济也能产生积极影响[1]。由于六倍体小麦的基因组资源不如拟南芥和水稻等典型植物的基因组资源先进，因此在基因水平上没有太多关于小麦性状的信息[1]，这使得对小麦复杂的根
系研究更具有挑战性[8]。很多研究者在基因水平上仅对小麦根系进行了一些控制小麦根系性状的基因组区域（数量性状基因座）的研究[5，9-10]。而比较基因组学的发展为小麦相关性状的研究提供了可能性[11-13]。
近年来，在水稻中已经发现了很多影响根形成的基因突变体[14-18]。如水稻RAA1是关于无冠根的突变体，影响不定根发育、侧根减少和向地性部分缺失等[18]。研究表明，水稻根系相关基因RAA1（ROOT ARCHITECTURE ASSOCIATED1）还可以提高水稻对水分胁迫的耐受性。
本研究对水稻RAA1基因在小麦中的直系同源基因TaRAA1进行了鉴定，并绘制RAA1在各物种染体中的物理位置和进化树，对其核苷酸序列和蛋白结构进行分析。并预测了启动子区域顺式元件和转录因子结合位点（TFBS），对小麦的直系同源物种如大麦（HvRAA1），水稻（OsRAA1），节节麦（A thRAA1），乌拉尔图小麦（TuRAA1），野生二粒小麦（TtRAA1）和短柄草（BdRAA1）的同源基因进行比较分析。对TaRAA1在中国春小麦中的时空表达特性及渗透胁迫的响应模式进行定量分析，为探究TaRA A1基因分子特性及在小麦胁迫方面的功能提供研究思路与理论基础。1材料和方法
1.1试验材料与处理
本研究用于TaRA A1基因时空表达模式分析的材料为中国春小麦，播种于四川农业大学温江试验田，行长为2m，每行播种20粒中国春小麦种子，行距为0.3m，播种时，分别以80和100kg/hm2的比例施用氮
肥和过磷酸钙肥料，所有的试验场均按照当地的标准做法进行了灌溉和管理[19-20]。在小麦三叶期时，将长势一致的幼苗分别做不同胁迫处理，胁迫处理方法参考李敏论文[21]。具体如下。高盐胁迫：给予小麦幼苗浇灌200mmol/L的氯化钠（NaCl）溶液，每株50mL，模拟植物在盐胁迫下的生长条件；干旱胁迫：用蒸馏水将小麦幼苗根部冲洗干净，然后放在干燥的滤纸上，置于田间，模拟植物在干旱胁迫下的生长条件；高温胁迫：将生长健壮的小麦幼苗放于42℃的培养箱中；低温胁迫：将小麦幼苗放于4℃的恒温光照培养箱中模拟低温生长条件；植物激素ABA胁迫：给予小麦幼苗浇灌150μm的
ABA溶液。以未处理的中国春小麦幼苗作为对照，每项胁迫处理均设置3次生物学重复。
1.2基因与氨基酸序列获取
基因全长及基因编码序列（CDS）序列获取与氨基酸序列分析均参照前人所用的方法[12,20]。具体步骤如下：首先，使用NCBI BLAST（https：//www.ebi.ac. uk/Tools/sss/ncbiblast/nucleotide.html）工具查水稻RAA1基因的全长编码区序列，水稻RAA1基因的ID为Os01g0257300；获得水稻RAA1基因全长序列后将其在小麦数据库进行比对，得到小麦RAA1的同源基因序列；最后，在数据库中将下载的水稻RAA1的CDS与小麦、大麦、水稻、乌拉尔图小麦、野生二粒小麦和短柄草的CDS进行比对和分析，采用BLAST++BLASTN算法，E值设置为10-5，确定基因组全长序列和启动子序列[22]。
小麦参考基因组序列（V1.0）、大麦参考基因组、节节麦参考基因组（AetV4.0）、乌拉尔图小麦参考
基因组和野生二粒小麦全基因组序列从http：// 202.194.139.32/getfasta/index.html下载；水稻和短柄草参考基因组下载自http：///。
646
张雪梅，等：一个小麦中水稻根系直系同源基因的分子鉴定及表达分析
第6期表1本试验所用RT-qPCR 引物信息Table 1Details of primers used in this study
引物
Primer 序列（5'-3'）Sequence （5'-3'）
退火温度
Annealing temperature/°C
F
CAGCCGCGCTTGTGGAACT 60
R AAGGCGCTGCTGCA -
CACGCCGA
β-actin-F1CTCCCTCACAACAACCGC 60
β-actin-R1TACCAGGAACTTCCATAC
-
CAAC
1.3TaRAA1基因的染体定位分析
将获得的RAA1基因的全长序列与目标物种
的染体组序列进行对比（E 值设置为10-5）[20]
，以确定各基因在染体上的物理位置。1.4
同源基因序列比对和系统发育分析
在本研究中，利用MEGA 6.0软件将水稻、小麦、野生二粒小麦、短柄草、节节麦和乌拉尔图小麦中的R
AA 1基因组序列进行多重比对，同时采用邻近法构建系统发育树，进行RAA1的系统进化分析[23-26]。1.5
核苷酸结构和蛋白质结构分析
将RAA1的CDS 序列与全长序列进行比对，采用GSDS 2.0软件绘制基因的结构图[27]。利用MEGA 6.0软件[25]将获得的基因CDS 序列转换为氨基酸序列，在SMART （http ：//bl-heidelberg.de/）网站上识别这些物种的氨基酸序列，并绘制蛋白结构图[28]。
1.6启动子中的顺式作用元件分析和转录因子结合位点预测
在PlantCARE 数据库中对小麦、大麦和水稻等
的RAA1启动子区域5端上游的1000bp 碱基序列进行顺式作用元件进行比较和分析[29]，确定共同元素。水稻RAA1基因启动子序列的转录因子结合位点使用http ：//g/网站[30]进行预测，并在http ：//ad.csic.es/footprintdb 上进行确认[31]。1.7
表达模式分析
为了分析小麦RAA 1基因的表达模式，使用expVIP （http ：//www.wheat-expression/）检索得到R
A A1的表达量（transcripts per million ），同时使用WheatExp （http ：//wheat.v/WheatExp/）网站中检索的FPKM （fragments per kilobase of exonper million mapped reads ）进行RA A1的表达量分析。此
外，大麦的转录组数据参照Zhang H.等[12]的方法、水稻转录组数据根据Zou D.等[32]发布的数据用于后续的表达分析。1.8
RNA 的提取及cDNA 第一链的合成
采用J.C.Zadoks 时期[33]来划分小麦生长阶段的各个时期。中国春小麦的时空表达验证材料收集情况如下：拔节期-叶、三叶期-叶、分蘖期-叶、三叶期-根、第二节出现-穗、旗叶叶舌刚露出-穗、一半
开花-穗、拔节期-茎、假茎直立-茎、第二节出现-茎、旗叶叶舌刚露出-茎、籽粒充水、早期乳状-籽粒、中期乳状-籽粒、后期乳状-籽粒、早期面筋-籽
粒，使用总RNA 提取试剂盒Plant RNA Kit R6827（Omega Bio-Tek ，American ），按照说明书提供的步骤提取各组织总RNA 。
胁迫处理的材料分别于处理4h 、12h 时，取幼苗的根和叶子迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存，按照说明提取总RNA 。每个样本设置3次生物学重复。用0.9%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取样本
RNA 浓度和纯度。按照宝生物公司反转录试剂盒
（Takara PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser
（Perfect Real Time ））的说明书上提供的方案进行反转录，得到的cDNA 用于后续RT-qPCR 试验。1.9
引物设计与RT-qPCR 分析
为了提高网站和数据库中结果的可靠性，对TaRAA1进行了qRT-PCR 试验，进一步验证。利用
DNAMAN 软件对TaRA A1基因进行序列比对，设计RT-qPCR 通用引物。以制备好的cDNA 为模板进行
qRT-PCR 扩增。反应体系为：2×SYBR Green Ⅱ混合
物5μL ，上下引物各0.5μL ，cDNA 100ng ，加ddH 2O
至10μL 。反应程序为：94℃预变性5min ，94℃变性30s ，60复性30s ，72℃延伸30s ，进行35个循环；72℃延伸10min 。以茁-actin 基因（表1）作为参考，每个定量试验进行3次技术重复。基因相对表达水平采用2-△△CT 方法进行计算。利用SPSS 软件进行数据显著性分析。
2
结果与分析
2.1
TaRAA1基因的染体定位
染体定位结果表明，小麦TaRAA 1的同源基
因分别位于3A 、3B 和3D 染体的短臂上；水稻OSRAA 1被定位到1号染体的短臂上；大麦
(HvRA A1)被定位到3H 染体的短臂上；野生二粒小麦TtRAA1被定位到3A ，3B 染体短臂上，短柄草BdRA A1基因被定位到2号染体上，拟南芥AtRAA1基因被定位在第5号染体上(图1)。
647
2.2RAA1基因结构
基因结构分析结果显示，RAA 1基因在所有分
析的物种中均无内含子（图2）。RAA1基因组序列长度为176bp （乌拉尔图小麦）到339bp （拟南芥），TaRAA1、TtRAA1、HvRAA 1和AtRAA1基因组序列均为321bp 。2.3
蛋白质结构与系统发育分析
蛋白质结构分析结果显示，在本试验所研究的几个物种中，RAA1除了在水稻和小麦的3A 染体
上的同源基因中检测到一个低复杂区域外，在其余物种均没有检测到任何功能域，图3a 展示了RAA 1在各物种中的蛋白结构。系统发育分析结果表明，在所分析的物种中，小麦及其近缘属种聚集在了一个体中，而与水稻和短柄草RA A1的关系较远（图3b ）。2.4
启动子分析
对小麦TaRAA 1、大麦HvRAA1和水稻的OsRAA1基因启动子区域进行顺式作用元件分析，结果表明，这3个物种的RAA1启动子区域分别存在14、17和42个元件。RAA1基因在小麦、大麦和水稻中共鉴定出了5种常见的元素（表2）。其中TATA-box 是一种核心启动子元件，在转录起始的-30bp 左右；ABRE 元件是参与脱落酸反应的顺式作用元件；TGACG-基序及CGTCA -基序是参与
MEJA 反应的顺式作用调节元件（表2）。
转录因子结合位点的预测结果表明，小麦
TaRAA1-3A,3B,3D 、大麦HvRA A1和水稻OsRAA 1基因分别表现出包括A BI3、ABI5、ABF2、A BF3、AG 、abi4和Adof1在内的7种常见基因序列（表3）。
2.5
中国春小麦的TaRAA1基因对胁迫的响应
为了更好地了解RAA1的基因功能，通过基因表达网站expVIP 和WheatExp 分析了
TaRAA1-
Tu 代表乌拉尔图小麦；其余物种缩写如图1。Tu for T.urartu .Abbreviations are the same as those given in Figure 1.图2
RAA1基因在各物种中的基因结构分析Figure 2
Gene structure analysis of the RAA1gene in
various species
图中字母代表各物种染体的缩写：Ta 代表普通小麦；Os 代表水稻；Tt 代表野生二粒小麦；Ath 代表节节麦；Hv 代表大麦；Bd 代表短柄草；At 代表拟南芥；Chr 代表染体。
Species abbreviation ：Ta for T.aestivum ；Os for O.sativa ；Tt for T.turgidum ；Hv for H.vulgare ；Bd for B.distachyon and At for A.thaliana ；Chr for chromosome s.
图1RAA1基因在各物种染体上的物理位置
Figure 1Physical location of RAA1orthologs on the chromosomes in various species
第38卷
四川农业大学学报648
名称Name
功能Function
TATA-盒
核心启动子位于转录起始点上游-30处
ABRE
参与脱落酸反应的顺式作用元件
TGACG-基序
参与MEJA 反应的顺式作用调节元件
CGTCA-基序
参与MEJA 反应的顺式作用调节元件G-盒
光反应中的顺式作用调节元件
表3RAA1基因启动子在小麦、大麦和水稻中预测的转录因子
Table 3Putative common TFBS of RAA1promoters in wheat ,barley ,and rice
编号ID 名称Name
预测的序列（物种）Predicted sequence （Species ）
MA0564.1ABI3CCGCATGCA （大麦Hv ）ABI3GTGCATGCA （水稻Os ）ABI3CTGCATGCA （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA0931.1ABI5CGACACGTCA （大麦Hv ）
ABI5
CCCCACGTAT （水稻Os ）ABI5CGACACGTCA （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA0941.1ABF2
TTTGACATGTGTC （大麦Hv ）
ABF2GATAACATGTGTT （水稻Os ）ABF2TTTGACATGTGTC （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA0930.1ABF3
ACATGTGT （大麦Hv ）
ABF3ACATGTGT （水稻Os ）ABF3ACATGTGT （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA0005.1AG CCTAACCTAGC （大麦Hv ）AG
TTTTCCAATTAGGTATAT （水稻Os ）
AG
CCTTTTTTAGC （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA0123.1
abi4CGCGGCCGCT （大麦Hv ）abi4
CTCTGCCCCC （水稻Os ）
abi4
CGCGGCCGCC （小麦Ta-3A ，3B ，3D ）MA1277.1
Adof1AAAATTGAAAAGAAAGAATGT （大麦Hv ）Adof1ATCTCTAAAAAGAAGAAAAAT （水稻Os ）Adof1AAATATATAAAGAATATATCA （小麦Ta-3A ）Adof1
AAAATTGAAAAGAAAGAATGT （小麦Ta-3B ，3D ）
表2
RAA1基因启动子在大麦，水稻和小麦中预测的顺式元件
Table 2
Putative common cis-element of RAA1promoters in barley ,rice ,and wheat
a ：RAA1在各物种中的蛋白结构图，其中红线条代表蛋白的低复杂度区域；
b ：RAA1在小麦及其近缘物种中的系统进化树。
a ：The protein structure of RAA1in various species ，in which the red square lines represent the low complexity regions ；
b ：phylogeneti
c tree of RAA1in wheat an
d its related species.
图3RAA1在各物种中的蛋白结构及系统发育树
Figure 3Protein structure and phylogenetic tree of the RAA1in various species
张雪梅，等：一个小麦中水稻根系直系同源基因的分子鉴定及表达分析第6期649
发布评论