周玲吕孙慧①张惟材①舒伟②熊向华①（广西医科大学基础医学院，南宁 530021）中图分类号R392.33 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）05-1046-04
［摘要］目的：建立A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测方法。方法：以高亲和力人源抗体ML01作为捕获抗体，以小鼠腹水诱生法制备的鼠源抗体BAS46为检测抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测方法，并评价其灵敏度、重复性、检测线性范围和加样回收率等。结果：A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测法的灵敏度为2.56 pg/ml，变异系数为3.183%~12.030%，线性范围为0.244~62.500 ng/ml，回收率为90%~110%。结论：成功建立了A型肉毒毒素双抗体夹心ELISA检测方法，该方法快速、有效。
［关键词］A型肉毒毒素；双抗体夹心ELISA；单克隆抗体
Establishment of double-antibody sandwich ELISA for botulinum toxin type A ZHOU Ling，LYU Sunhui，ZHANG Weicai，SHU Wei，XIONG Xianghua. Basic Medical College of Guangxi Medical University， Nanning 530021， China
［Abstract］Objective：To develop a double-antibody sandwich ELISA for botulinum toxin type A. Metho
ds：Using high affinity human antibody ML01 as capture antibody， mouse antibody BAS46 prepared by mouse ascites induction as detection antibody， and sheep anti-mouse IgG labeled with HRP as secondary antibody， a double antibody sandwich ELISA method for detection of botulinum toxin A was established， whose sensitivity， repeatability， detection linear range and recovery rate were evaluated. Results：Sensitivity of botulinum toxin type A double antibody sandwich ELISA detection method was 2.56 pg/ml， coefficient of variation was 3.183%~ 12.030%， linear range of detection was 0.244~62.500 ng/ml， and recovery was 90%~110%. Conclusion：A double-antibody sandwich ELISA for botulinum toxin type A detecting is successfully developed， which is rapid and effective.
［Key words］Botulinum neurotoxin type A；Double-antibody sandwich ELISA；Monoclonal antibody
肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是目前已知毒性最强的毒素，小鼠致死剂量为0.3 ng/kg，人类致死剂量为1.3~2.1 µg/kg［1-2］。因制备简单、毒性强、难被列为六大A类生物战剂之一［3］。根据毒素血清学特性，目前已从不同肉毒杆菌菌株中鉴定出至少7种BoNT（A~G），其中A型BoNT毒性最强［4］。A型BoNT中毒尚无有效药物，除食源性BoNT中毒，医源性BoNT中毒也时有发生，严重危害公众生命安全［5］。因此，建立快速、准确、灵敏、稳定的检测方法对医学诊断、公共卫生安全和生化反恐具有重要意义。
目前传统毒素检测“金标准”为小鼠生物实验（mouse lethality bioassay，MLB），但实验周期长、消耗大，涉及实验动物福利和伦理问题［6］。其他检测方法，如细胞法、质谱法、电化学发光法、化学发光法、荧光PCR等，需要专门仪器设备和特殊的实验环境。本研究拟建立一种A型BoNT检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料 6~8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）；Protein-G亲和层析柱（GE公司）；小鼠单抗Ig类/亚型鉴定试剂盒（北京博奥龙免疫技术有限公司）；SDS-PAGE上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制溶液（上海生工）；
96孔酶标板（NEST）；HRP标记的羊抗鼠IgG （Thermo公司）；TMB（索莱宝公司）；Easysee Western blot Kit（北京全式金生物技术有限公司）；杂交瘤细胞株BAS46（本实验室筛选保存）；单克隆抗体BAS46为纯化抗体；ML01抗体（本实验室保存，专利号：ZL201910584470.X）。
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.05.028
①军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京 100071。
②桂林医学院生物技术学院，桂林 541100。
作者简介：周玲，女，硕士，主要从事单克隆抗体方面的研究，E-mail：290483980@qq。
通信作者及指导教师：舒伟，男，博士，教授，主要从事分子遗传学
研究，E-mail：shuwei7866@126。
熊向华，男，博士，副研究员，主要从事单克隆
抗体及应用研究，E-mail：xiongxianghua@sina.
com。
1.2 方法
1.2.1 单克隆抗体腹水制备与纯化 BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡（0.5 ml/只），2周后腹腔注射对数生长期杂交瘤细胞（1×106个），7~10 d后收集腹水备用，采用AKTA层析系统和Protein-G亲和层析柱进行纯化。
1.2.2 纯度测定 采用12.5%SDS-PAGE分析抗体纯度，取1.0 µg抗体经处理后进行SDS-PAGE电泳，扫描后采用软件Gelpro 32分析纯度。
1.2.3 抗体特性鉴定 按照小鼠单抗Ig类/亚型鉴定试剂盒说明书对Protein-G纯化后的抗体进行单抗亚型测定。间接ELISA法检测腹水效价，取cut-
off>2.1的最小稀释倍数为抗体腹水效价。Western blot鉴定抗体特异性，取5.0 µg A、B、E、F型BoNT 作为抗原进行12.5%SDS-PAGE分析，半干法移至PVDF膜，含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1 h，鼠源抗体BAS46采用含5%脱脂奶粉的PBST稀释500倍为一抗，加入稀释后的一抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，10 min/次，加入1 µg/ml HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育1 h，PBST洗膜3次，10 min/次，ECL化学发光显剂显，化学发光仪显影。
1.2.4 间接ELISA测定BAS46抗体亲和力常数 以A型BoNT重链（BoNT/AHc）为抗原，测定抗原（5.000、2.500、1.250、0.125 µg/ml）与抗体的结合反应曲线，4×10−6~20 µg/ml抗体取15个浓度，SPSS 软件进行曲线拟合后得到各抗原浓度对应最大OD450 nm一半时的抗体浓度。采用赵巧林等［7］的计算方法计算抗体BAS46的亲和力常数。
1.2.5 条件优化 确定夹心ELISA法实验条件，确定捕获抗体，方案一以人源抗体ML01为捕获抗体，BAS46为一抗，方案二以BAS46为捕获抗体，人源抗体ML01为一抗；确定捕获抗体浓度，分别为1.0、5.0 µg/ml，确定二抗稀释倍数，按1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000进行稀释。
1.2.6 夹心ELISA法标准曲线及线性范围标准曲线建立 包被捕获抗体100 µl/孔加至96孔酶标板，4 ℃过夜，空白不包被捕获抗体PBST洗板后5%脱脂奶粉300 µl/孔封闭2 h，PBST洗板，抗原BoNT/ AHc以100 µg/ml为初始浓度5倍梯度稀释为14个浓度梯度（100 µl/孔），37 ℃孵育1 h，阴性不加抗原，加入
合适浓度的检测抗体（100 µl/孔） 37 ℃孵育1 h，PBST洗板加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000稀释），37 ℃孵育1 h，PBST洗板，TMB显液避光显10 min，加入2 mol/L浓硫酸终止反应，酶标仪测450 nm处OD值，建立夹心ELISA标准曲线。线性范围测定：抗原BoNT/AHc以1.0 µg/ml为初始浓度4倍梯度稀释为11个浓度梯度，其余同标准曲线建立。
1.2.7 灵敏度与重复性测定 各样品重复3次，抗原BoNT/AHc以1.0 µg/ml为初始浓度5倍梯度稀释为12个浓度，其余同标准曲线建立。
1.2.8 加样回收率测定 分别取0.062 5、0.015 6、0.003 9 µg/ml抗原BoNT/AHc进行回收率测定，制备大肠杆菌BL21（DE3）裂解液。将1.0 µg/ml抗原BoNT/AHc采用菌裂解液稀释为0.062 5、0.015 6、0.003 9 µg/ml，夹心ELISA法测定浓度，计算回收率和变异系数。
1.2.9 特异性测定 采用已建立的双抗体夹心ELISA法分别检测本实验室制备的重组A、B、E、F 型BoNT，抗原浓度均为10 µg/ml。
1.2.10 采用已建立的双抗体夹心ELISA法检测A 型BoNT A型BoNT毒力为2.56×106 LD50/ml，抗原按25.60 LD50/ml开始3倍梯度稀释为14个浓度梯度，阴性不加抗原。
1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计学分析和曲线拟合，所有数据至少重复3次，数据以xˉ±s
表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析，多重比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 鼠源单抗BAS46制备 制备的腹水经Protein-G 亲和层析进行抗体纯化后，得到鼠源抗体BAS46，SDS-PAGE分析结果（图1）显示，条带相对分子质量分别位于25 kD和50 kD附近，与抗体轻重链大小基本一致，Gelpro32软件分析其纯度>95%，说明纯化效果良好，
可用于后续实验。
Note：M. Marker； 1. Monoclonal antibody BAS46.
图1 抗体BAS46的SDS-PAGE电泳分析
Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis analysis of antibody BAS46
2.2 鼠源BAS46单克隆抗体鉴定 小鼠单抗Ig 类/
亚类试剂盒鉴定显示，鼠源单抗BAS46重链为IgG2a ，轻链为κ型（图2）。间接ELISA 法检测亲和纯化后腹水型单抗BAS46效价为1×104。分别以A 、
B 、E 、F 型BoNT 为抗原，鼠源单抗BAS46为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗进行Western blot 鉴定，结果显示，鼠源单抗BAS46与A 型BoNT 结合，
张雅玫与B 、E 、F 型BoNT 均不结合（图3）。
2.3 鼠源单抗BAS46亲和力常数测定 采用非竞争ELISA 法测定4个浓度（5.000、2.500、1.250、0.125 µg/ml ）抗原BoNT/AHc 分别与15个浓度梯度鼠源单抗BSA46的结合反应曲线（图4），SPSS 软件
拟合后计算鼠源单抗BAS46的亲和力常数为2.20×10−9 mol/L ，提示鼠源单抗BAS46与抗原结合能力较强。人源抗体ML01亲和力可达fmol 级。
2.4 最佳工作条件 确定了最佳工作条件为以人源抗体ML01为捕获抗体，鼠源抗体BAS46为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗，稀释倍数为1∶10 000。
2.5 标准曲线建立及线性范围 标准曲线（图5A ）结果显示，夹心ELISA 法的线性范围为0.244~62.500 ng/ml ，线性方程为y =0.128 3x +0.586 5，R²=0.992 4（图5B ）。
2.6 灵敏度与重复性 分别考察了BoNT/AHc 灵敏度为2.050×10−9~1.000 µg/ml 时12组OD 450值，每组设3个平行，结果显示灵敏度为2.56 pg/ml ，CV%
为3.183%~12.030%，提示实验重复性良好（表1）。 2.7 加样回收率测定 测定大肠杆菌BL21（DE3）裂解液对夹心ELISA 方法准确度是否有影响，结果显示，将1 µg/ml 抗原BoNT/AHc 采用大肠杆菌BL21（DE3）裂解液稀释为0.062 5 µg/ml 时，回收率为87.81%~119.85%；稀释为0.015 6 µg/ml 时，回收率为73.23%~101.25%；稀释为0.003 9 µg/ml 时，回收率为79.14%~119.81%。提示大肠杆菌BL21
（DE3）裂解液不影响测定，回收率为90%~110%，说明方法准确度较高，符合要求（表2）。
2.8 特异性测定 采用建立方法检测BoNT ，结果显示，夹心ELISA 法仅识别A 型BoNT （P <0.001），不识别B 、E 、F 型BoNT ，与阴性对照差异无统计学意义（P>0.05），说明建立的夹心ELISA 法特异性良好（图6）。
表1 夹心ELISA 灵敏度和重复性
Tab.1 Sensitivity and repeatability of sandwich ELISA
Antigen/（µg ·ml −1）1.000
2.000×10−14.000×10−28.000×10−316.000×10−432.000×10−56.400×10−51.280×10−52.560×10−65.120×10−71.024×10−82.050×10−9
Control
OD 450
Tester 10.6370.4120.4120.4100.3720.3540.3370.3050.2850.1670.1540.1340.110Tester 20.5950.4010.
3820.3510.3440.3030.2910.3140.2300.1580.1280.1240.115Tester 30.5330.3780.3340.3250.3010.3000.2820.3250.2530.1730.1560.1490.118
Mean
0.588
0.3970.3760.3620.3390.3190.3030.3150.2560.1660.1460.1360.114CV/%
8.8934.37010.46012.03010.5509.5139.7263.18310.7904.54810.7009.2753.
550
图3 抗体BAS46与A 、B 、E 、F 型BoNT Western blot 鉴定Fig.3 Western blot identification of antibody BAS46 with
BoNT A ， B ，
E and F
图2 抗体BAS46亚型鉴定
Fig.2
Identification of antibody BAS46 subtypes
图5 夹心ELISA 标准曲线及线性检测范围
Fig.5 Standard curve and linear detection range of sand⁃
wich ELISA
图4 抗体BAS46亲和力常数测定
Fig.4 Affinity constant of antibody BAS46 determination
2.9 A 型BoNT 测定 采用建立的ELISA 法检测A 型BoNT ，结果显示，检测下限可达0.53 LD 50/ml
（图7）。
3 讨论
过去十几年，快速和可靠检测BoNT 的替代技术开发取得了长足进步，如肽链内切酶ELISA 法、镧系荧光技术定量、实时荧光定量PCR 等，符合动物
实验3R 原则并尽可能取代了MLB ［3，8-9］
。与MLB 相
比，以上方法具有各自优缺点，从复杂样品中同时检测血清型将是诊断和食品检测的关键要求，同时确保快速和低成本，基于此ELISA 法脱颖而出，具有明显优势。随着高亲和力抗体发展，国外建立的
ELISA 法灵敏度可达0.20~2.20 pg/ml ，可特异性区分BoNT 血清型［10-12］。国内李永明［13］等建立的高灵敏度ELISA 法理论检测下限可达8.34 pg/ml 。本研究建立的夹心ELISA 法可特异性结合A 型BoNT ，与B 、E 、F 型BoNT 则无交叉反应，能准确鉴定A 型BoNT ，理论检测下限可达2.56 pg/ml 。
综上，本研究采用人源化单克隆抗体ML01与
鼠源化单克隆抗体BAS46成功构建了检测A 型BoNT 的双抗体夹心ELISA 法，灵敏度可达到pg 级，
具有高灵敏度及高特异性，重复性良好。
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［收稿 2021⁃11⁃26 修回 2022⁃01⁃02］
（编辑 周文瑜）
表2 夹心ELISA 回收率
Tab.2 Recovery rate of sandwich ELISA
Antigen/
（µg ·ml −1）0.062 50.015 60.003 9n 1
23123123
Detection value/（µg ·ml −1）0.054 90.064 10.074 90.015 00.015 80.011 40.003 20.004 70.003 1
Recovery/%87.81102.59119.8596.14101.2573.2381.22119.8179.14
Mean 103.4290.2193.39
CV/%15.5016.5424.
52
Note ：***. P <0.001.
图6 夹心ELISA 法特异性测定结果
Fig.6
Sandwich ELISA linear special verification results
图7 夹心ELISA 法测定A 型BoNT 的标准曲线及灵敏度Fig.7 Standard curve and sensitivity of BoNT A by
sandwich ELISA
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