口腔是人体的第一道门户，也是消化系统的第一道关口，并与呼吸系统密切相关，此外还是人类语言表达的功能器官［1］。在人体口腔内寄居着数以亿计的微生物，它们与人体口腔保持着亲密且永久的关系，维持着口腔与微生物的动态平衡［2］，对人体的健康有着重要影响，是人体微生物的重要组成部分。口腔微生物种种类繁多、组成复杂，受到人的生活环境和生活习惯的影响。
人类口腔是微生物栖息的重要场所之一，口腔微生物落是人体最复杂微生物落之一，由超过700种微生物构成［3］。口腔微生物落与宿主之间存在密切关系，影响着人体的健康，当微生物落与宿主之间生态关系失衡时将会导致口腔慢性感染疾病，更为关键的是口腔微生物可以作为病灶牵连全身系统性疾病［4］。一般来说，口腔疾病通过以下途径影响全身健康：①影响口腔的功能，从而影响全身健康；②通过口腔微生物组对全身健康造成影响；③通过口腔感染引起的炎症反应影响全身健康［5］。为初步了解西藏大学在校大学生的口腔健康情况、分析漱口对口腔清洁的作用以及饮食习惯是否会影响口腔细菌落的组成。
1材料与方法
1.1实验样品
采用随机抽样的方法从同年级不同班级不同地域的学生中抽取汉族男生5名、汉族女生5名、藏族男生5名、藏族女生5名。用无菌试管分别采集早上刷牙后的以及晚上刷牙前的唾液各5毫升。用45毫升无菌水稀
释备用。
1.2培养基
选用牛肉膏蛋白胨培养基。
1.3口腔细菌的分离
将稀释后的各同学唾液摇匀后用移液移取0.5毫升滴于平板中心，按照涂布平板的方法进行接种，男女共20人，每个处理设三个重复。37℃恒温培养1-3d后观察并记录结果。
1.4口腔细菌的纯化
将平板培养后的细菌进行平板菌落计数和固体培养特征记录，随后挑取菌落并进行平板划线纯化。纯化后置于37℃培养箱中培养1-3d，共得到436株细菌。
将纯化的菌株根据菌落颜、边缘形态、透明度
口腔细菌的分离与鉴定*
——以西藏大学在校大学生为例
张贤哲闵蒙乐卓玛常诚德吉**
（西藏大学理学院，西藏拉萨850000）
摘要：研究通过抽取20位在校大学生分离其口腔细菌，共获得细菌436株，鉴定为4个属，7个种，其中芽孢杆菌为优势种。分析得出，该校大学生口腔环境基本健康，刷牙前后细菌数量差异明显，说明有效的清洁口腔有利于保证健康的口腔环境，并能够减少患口腔疾病的风险。不同人人体口腔细菌多样性差异分析结果表明，男女、藏汉学生多样性无明显差异。
关键词：西藏大学口腔细菌分离鉴定
*基金项目：2017年度国家级大学生创新性实验训练计划项目“黄苞南星提取物对人体口腔细菌体外抑菌效果及其内生菌的研究”
（201710694008）
**通讯作者
41
表1人体口腔细菌固体培养及显微形态特征序号颜边缘形态透明度质地革兰氏染有无芽孢
KJ-4黄
规则
不透明光滑
阳性无KJ-6米黄不规则不透明粗糙阳性有KJ-7淡白不规则不透明粗糙阳性有KJ-9
淡白
不规则不透明光滑阳性有KJ-10淡白不规则不透明粗糙阳性有KJ-13淡白规则半透明光滑
阳性有KJ-15淡白不规则不透明粗糙阳性有KJ-16淡白不规则不透明粗糙阳性有KJ-19白
不规则不透明粗糙阳性无KJ-20乳白
不规则
不透明粗糙阳性无KJ-22淡白不规则不透明粗糙阳性有KJ-23乳白不规则不透明粗糙阳性有KJ-24
白
规则
半透明光滑
阴性
无
质地和显微形态进行归类，将436株细菌归为13组。1.5口腔细菌的形态特征
在归类的13组细菌中，除KJ-4、KJ-19、KJ-20、
KJ-24外，其余各组细菌均有芽孢；除KJ-24外，其余各组细菌均为革兰氏阳性菌；其中淡白菌落占大多数；透明度以不透明为主。各组细菌固体培养特征和显微特征见表1。
2结果与分析
2.1人体口腔细菌的16Sr DNA 测序结果及分析
常诚对纯化后的菌株进行菌落形态观察、革兰氏染
和16Sr DNA 的扩增和测序。细菌采用16SrDNA 通用引物27f （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492r （5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。PCR 产物经纯化后由成都丹凤科技有限公司测序。获得的16Sr DNA 序
列提交Gen Bank 并取得如下序列号:9M715VKR014、9M79H8MP014、9M7FZND5015、9M7N0MM8014、9M7TB00G014、9M7X2B22015、9M841K7W014、9M89285N014、9M8DZ2M0014、9M9E67R5014、9M8W1SPD014、9M924XNU01R、9M95EXE001R 。
形态特征以及分子生物学结果显示：KJ-4为金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）；KJ-6为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus safensis ）；KJ-7为芽孢杆菌属（Ba-cillus sp.）；KJ-9为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）；KJ-10为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；KJ-13为单纯芽孢杆菌（Bacillus simplex ）；KJ-15为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；KJ-16为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；KJ-19为蛋白解聚菌属（Proteolyticus sp.）；KJ-20为棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）；KJ-22为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；KJ-23为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；KJ-24为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。
获得的人体口腔细菌中，Bacillus sp.分布比例为46%，占比最高，属于优势菌种；Bacillus cereus、Bacil-lus simple、Proteolyticus sp.、Corynebacterium sp.、Pseu-domonas sp.则均以8%的比例分布；其中芽孢杆菌属（包括Bacillus sp.、Bacillus safensis、Bacillus cereus、Bacillus simplex ）总共占比为76.9%.2.2刷牙前后人体口腔细菌多样性分析2.2.1刷牙前后人体口腔细菌分布状况。
2.2.1.1早晨刷牙后人体口腔细菌分布状况。表2数据显示，20位同学于清晨洗漱过后的口腔细菌包括3个属，3个种。其中Bacillus sp.分布最广，出现频率为30%，分布于6个样品。相对丰度表明，芽孢杆菌为优势菌株。
表2
早晨刷牙后人体口腔细菌分布状况
1
2
3
4
56
7
8
910
11
12
13
14
15161718
19
20
出现频率%相对丰度%Bacillus sp.
1
2
3
5
10
6
30.00
27.27
Bacillus cereus --Bacillus simplex --Bacillus safensis --Corynebacterium sp.4
1
10.0045.45Proteolyticus sp --Staphylococcus aureus
3
6
10.0027.27
注：1-5号样品为汉族男生;6-10号样品为藏族男生;11-15号为汉族女生;16-20号为藏族女生.＂-＂表示由于没有数据而无法进行结果分析
′′′′2.2.1.2晚上刷牙前人体口腔细菌分布状况。表3显示，20位同学通过一天的活动饮食后分离得到的口腔细菌分属于3个属，6个种。其中Bacillus sp.分布最广，出现频率占到85%，分布于17个样品。其次，Staphylococcus aureus、Bacillus simplex 出现频率分别为30%和45%，各分布于6个和9个样品。
42
表4
早上刷牙后人体口腔细菌多样性指数
1
10.20.000.000.00210.80.000.000.00300.0---400.0---510.40.000.000.00600.0---710.60.000.000.00810.20.000.000.00910.60.000.000.001000.0---1100.0---1200.0---1300.0---1400.0---151 1.00.000.000.00161 2.00.000.000.00171 1.20.000.000.001800.0---191 1.20.000.000.002000.0---
Ba-cillus cereus 分布于4个样品。Proteolyticus sp.则分布于2个样品。Bacillus sp.相对丰度为71.61%，属于
优势菌株。Bacillus simplex 的相对丰度也较高，为11.56%.
表3
晚上刷牙前人体口腔细菌分布状况
123
4
5
67
8
910111213141516
17
181920出现频率%相对丰度%Bacillus sp.106341013151218
2512
13
52817
725
4585.0067.82Bacillus cereus 86
73
20.008.05Bacillus simplex 2
2
3
7
3
5
3
19
2
45.008.05Bacillus safensis 2 5.00 1.15Corynebacterium sp.--Proteolyticus sp.1
310.00 2.30Staphylococcus aureus
35
95
1
4
30.00
12.64
样品编号
细菌总丰度（×102
CFU/ml ）多样性指数D
多样性指数H’均匀度指数
J'种数
样品编号
细菌总丰度（×102CFU/ml ）多样性指数D
多样性指数H’均匀度指数J'种数
表5
晚上刷牙前人体口腔细菌多样性指数
14 3.00.680.550.4023 3.80.650.470.43327.20.100.090.1341 2.00.000.000.00510.20.000.000.0064 6.00.680.530.3873 4.60.510.380.3582 3.00.320.220.3191 3.60.000.000.00101 1.40.000.000.00111 5.00.000.000.00122 2.60.140.120.17132 3.20.330.210.30143 3.40.660.470.43151 5.60.000.000.00162 4.00.260.180.26171 3.80.000.000.00182 2.20.460.280.41191 5.00.000.000.0020410.00.400.340.24
2.2.2刷牙前后人体口腔细菌多样性指数。
2.2.2.1早上刷牙后人体口腔细菌多样性指数。从表4数据中可以看出，早上洗漱后，所有分离出细菌的样品其细菌种数均为1种。除4个样品细菌总丰度超过1×102CFU/ml 外，其余各样品细菌总丰度均偏低。
2.2.2.2晚上刷牙前人体口腔细菌多样性指数。从表5中可以看出，晚上刷牙前种数较早上刷牙后明显增多，1、6、20号样品均分离出4种细菌，2、7、14号样品均分离出3种，3、8、12、13、16均分离出2种，其余样品仅分离出1种。除5号和10号样品外，其余各样品细菌总丰度均大于2.0×102CFU/ml，3、6、11、15、16、19、20
号样品细菌总丰度大于4.0×102CFU/ml，其中20号样品细菌总丰度则达到1×103CFU/ml。分析多样性指数得出，1号样品和6号样品多样性指数最高，多样性最丰富，其次是14和2号样品，多样性指数超过0.6。
2.2.2.3刷牙前后口腔细菌多样性指数差异分析。根据表6数据可见，刷牙前后各数据均具有明显差异性（P<0.05）。
早上刷牙后3b 8.2b 0.50b 0.38b 0.16b 晚上刷牙前
7a
79.6a
0.47a
0.36a
0.10a
表6
刷牙前后口腔细菌多样性指数差异
样本
细菌总丰度
（×102CFU/ml ）
多样性
指数D 多样性指数H’
均匀度指数J'种数
43
样本
细菌总丰度
（×102CFU/ml ）多样性指数D
多样性
指数H’均匀度指数J'
种数
表10晚上刷牙前男女生口腔细菌多样性指数差异
男生7a 34.8a 0.55a 0.50a 0.26a 女生
5a
44.8a
0.44a
0.36a
0.22a
2.3不同人人体口腔细菌多样性指数差异分析2.
3.1早上刷牙后藏汉男女学生口腔细菌多样性指数差异。早上刷牙后藏汉男女学生各数据差异性结果表明（见表7），汉族男生、藏族男生、汉族女生以及藏族女生在早晨刷牙后口腔细菌无论种数、细菌总丰度以及多样性指数间均无显著差异。
2.3.2晚上刷牙前藏汉男女学生口腔细菌多样性指数差异。晚上刷牙后藏汉男女学生口腔细菌多样性指数间也无显著差异（见表8）。
2.3.3早上刷牙后男女生口腔细菌多样性指数差异。表9数据显示，早上刷牙后男女生口腔细菌种数以及三种多样性指数间均无显著差异。男女生口腔细菌总丰度具有一定的差异，但差异未达到显著水平。
2.3.4晚上刷牙前男女生口腔细菌多样性指数差异。晚上刷牙前男女生口腔细菌多样性指数差异结果表明（表10），男女生口腔细菌种数、细菌总丰度以及多样性指数间均无显著差异。 2.3.5早上刷牙后藏汉口腔细菌多样性指数差异。表11早上刷牙后藏汉口腔细菌多样性指数差异结果显示，藏族同学在进行洗漱后，口腔细菌种数、细菌总丰度以及多样性指数与汉族同学间无显著差异性。
2.3.6晚上刷牙前藏汉学生口腔细菌多样性指数差异。晚上刷牙前藏汉学生的口腔细菌多样性指数间无显著差异（如表12所示）。
3结论与讨论
在对早晨刷牙后的口腔细菌总丰度分析时，认为
在排除污染的可能性后，16号藏族女孩可能相较其他同学刷牙不太彻底，导致细菌总丰度偏高，但总体来说细菌总丰度都基本控制在200CFU/ml 以内。在分析晚上刷牙前的口腔细菌数据时，同学们的生活活动，包括饮食、呼吸、说话等，对口腔细菌落的影响是比较明显的，通过一天的活动后，各同学口腔细菌种数与细菌总丰度都明显增加，相较于早上刷牙后的数据也呈现明显的差异性（P<0.05）。
在研究藏汉口腔细菌落的差异时，分析两组实验的多样性指数，发现藏汉两族不论在刷牙前还是刷牙后其口腔细菌多样性构成都无明显差异，其口腔细菌种属构成基本一致，因此我们认为，在同一所大学相同环境中，藏汉口腔环境并无(下转47页)
样本
细菌总丰度（×102CFU/ml ）
多样性
指数D 多样性
指数H’
均匀度指数J'种数
表7
早上刷牙后藏汉男女学生口腔细菌多样性指数差异
汉族男生2a 1.4a 0.49a 0.30a 0.43a 藏族男生3a 1.4a 0.61a 0.44a 0.40a 汉族女生1a 1.0a 0.00a 0.00a 0.00a 藏族女生2a
4.4a
0.40a
0.25a
0.37a
注：标注不同字母的同列数据呈显著性差异（P<0.05）
样本
细菌总丰度（×102CFU/ml ）
多样性指数D 多样性
指数H’
均匀度指数J'种数
汉族男生6a 16.2a 0.48a 0.40a 0.22a 藏族男生6a 18.6a 0.57a 0.44a 0.25a 汉族女生4a 19.8a 0.29a 0.25a 0.00a 藏族女生5a
25.0a
0.33a
0.31a
0.19a
表8
晚上刷牙前藏汉男女学生口腔细菌多样性指数差异
样本
细菌总丰度（×102CFU/ml ）
多样性指数D 多样性
指数H’
均匀度指数J'种数
表11
早上刷牙后藏汉族同学口腔细菌多样性指数差异
男生3a 5.8a 0.47a 0.44a 0.40a 女生
2a
2.4a
0.33a
0.28a
0.40a
样本
细菌总丰度
（×102CFU/ml ）
多样性指数D 多样性
指数H’
均匀度指数J'种数
表12晚上刷牙前藏汉学生口腔细菌多样性指数差异
男生8a 34.0a 0.62a 0.29a 0.14a 汉族
6a
43.6a
0.39a
0.20a
0.11a
样本
细菌总丰度（×102CFU/ml ）
多样性指数D 多样性
指数H’
均匀度指数J'种数
表9
早上刷牙后男女生口腔细菌多样性指数差异
男生3a 2.8ab 0.64a 0.46a 0.42a 汉族
2a
5.4a
0.35a
0.23a
0.33a
44
接种月龄的婴儿易感性增加而发病，因此应考虑对适龄妇女进行麻疹疫苗接种，提高出生婴儿的麻疹胎传抗体水平，同时对8月龄以下的婴儿要避免到人流量大、空气不流通的场所，避免与出疹性疾病患者接触，更不要带婴儿到医院看望病人，如需到医院就诊，诊疗后也应该及时离开，不要在医院内逗留、游玩，以防增加麻疹的感染几率。
预防麻疹需注意：拉萨春季温差都比较大，早晚较冷，要特别注意增减衣物，阳光充足时要让室内接受日光充分照射，这样有利于室内杀菌、消毒；要合理安排一些体育锻炼及室外活动，提高自身的抵抗能力；每晚要保持充分的睡眠，睡眠状况会直接影响抵抗力水平；合理安排饮食也可以提高自身免疫力；
注意个人卫生，个人卫生在预防麻疹的过程中也起着关键的作用；注意空气流通，麻疹病毒是通过呼吸道分泌物飞沫传播的病毒，所以要经常开窗通风，注意保持室内空气流通，降低房间内病毒的浓度。
为控制拉萨市的麻疹疫情应做好以下几点：①控制传染源，对麻疹患者应做好“三早”，即早发现、早隔离、早，并及做好疫情报告；②切断传播途径，流行期间避免带易感者及婴儿到公共场所或探亲访友；患者住过的房间应开窗通风，病儿衣物用后
须及时暴晒或肥皂清洗；密切接触病人的家属及医护人员，离开时须在户外停留20分钟左右，方可接触其他易感者；③增强人免疫力，接种麻疹减毒活疫苗是预防麻疹的主要措施；体弱、患病、年幼的易感者接触麻疹后，可采取被动免疫以预防发病。
今后应加强各案的免疫史调查质量，只有得到详细的免疫史资料，才能更好地分析、预防、接种中存在的问题，有针对性地进行改进。
从监测系统的各项指标看，拉萨市麻疹监测的敏感性、及时性、特异性均较高，说明拉萨市的监测系统运转质量较好。
参考文献
［1］周波青，沈毅，于伟，等.绍兴县2005年麻疹疫情回升原因探讨［J］.浙江预防医学，2007，19（
5）：3-4.
［2］李倩，凌罗亚，蒋征刚，等.浙江省2001-2003年麻疹流行病学分析［J］.中国计划免疫，2005,11（1）：27-29.［3］李捐，卢莉，刘东磊，等.2005-2010年北京市麻疹流行病学特征与消除麻疹措施分析［J］.疾病监测，2012，27（5）：353-357.
编校王俭
（上接44页）明显差异，因此在条件允许的情况下我们将会在后期研究中对校园内外环境中藏汉两族口腔细菌多样性进行研究。
总的来说，大学生口腔环境基本健康，致病菌危害控制在合理范围内，是良好生活习惯的表现。其中芽孢杆菌属凭借其芽孢的抗逆境优越性在人体口腔细菌中占据绝对的优势地位，可能是由于芽孢杆菌属产生的芽孢有利于该菌属细菌在牙膏等常用口腔清洁用品以及口腔溶菌酶等的作用下保护菌种活力，并在其获得良好生活条件时（营养培养基、培养温度等）进行繁殖。其次，刷牙后人体口腔细菌种数和细菌总丰度均明显小于刷牙前的相关数据，说明清洁口腔的习惯有助于保持良好的口腔环境，并减少患口腔疾病的风险。而通过对晚上刷牙前与早上刷牙后的口腔环境对比，笔者认为就寝前清洁口腔能够更好地保护口腔环境。因此，为保护好良好的口腔环境，减少疾病的影响，应当注重个人卫生与环境卫生，按时清洁口腔，最好能够在每天起床与就
寝前都进行口腔清洁，每次刷牙时间不少于5分钟，保证口腔中芽孢杆菌的活力能够得到有效降低，并清除其他细菌，以保证我们良好的口腔环境［5］。
参考文献
［1］白玉兴，赵颖，吕亚林，等.口腔健康与全身健康［J］.中国医刊，2018，53（07）：697-701.
［2］周爽，蔡叶.口腔微生物落及疾病相关性研究［J］.临床医药文献电子杂志，2017，4（82）：16039-16044.［3］陈婷.健康青年人口腔微生物多样性分析［D］.广州：南方医科大学，2011.
［4］程兴，徐欣，周学东.口腔微生物与肠道微生物的关系［J］.华西口腔医学，2017，35（03）：322-327.［5］张丽妮，胡凤莲.牙周炎患者基础后口腔卫生宣教［J］.全科口腔医学电子杂志，2018，5（22）：19.
编校姚皖黔
47
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