小麦中呕吐毒素快速检测方法比较*
谢婷婷，林秀，陈凌峰
(福建省粮油质量监测所，福建福州350012 )
摘要：以小麦为原料，采用酶联免疫吸附法、肢体金快速定量法、时间分辨荧光免疫层析法及高效液相谱法 检测其呕吐毒素含量并探讨3种快速检测方法的准确性。结果表明，上述3种快速检测方法均适用于小麦中呕吐毒 素的检测，且具有准确性高、快速、简单、便携等特点。
关键词：呕吐毒素；酶联免疫法；肢体金快速定量法；时间分辨荧光免疫层析法；液相谱法
doi：10.3969/j.issn.l007-550X.2018.09.003
中图分类号：TS210.7 文献标识码：A文章编号：1007-550X(2018 ) 09-0020-05
目前，基于大型仪器的检测方法，由于仪器不 具有便携性、样品前处理操作比较复杂、检测需要 的时间较长、检测成本较高等原因无法满足短时间 内得出实验结果和现场快速检测的需求。快速检测 方法与大
型仪器方法相比，是一种能够将样品前处 理简化以及短时间内能对相关的质量安全指标得出 检测结果的技术[1]。
近年来，粮食中真菌毒素的危害性受到广泛关 注，其检测方法也越来越受到重视。呕吐毒素(vomitoxm)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（D O N)，它是一种由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，主要污 染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物[2]。
粮食中呕吐毒素快速检测方法有酶联免疫吸附 筛查法、胶体金决速定量法和时间分辨免疫层析法。酶联免疫吸附法(ELISA法)是把抗原和抗体的特异性 免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测 技术[3]也是国标规定的筛查方法[4]。胶体金快速定量 法是以胶体金层析免疫竞争为原理，以小分子化合 物为检测对象，运用侧流技术发展起来的一种真菌 毒素快速检测方法[5—7]，它具有检测速度更快、检测 成本较低，操作更简单等优点。时间分辨免疫层析法(time—resolved fluoroimmunoassay，T R FIA)是禾lj 用真菌毒素与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反 应，用时间分辨荧光免疫层析检测仪测定反应产物 中的荧光强度，前期的研究结果已证实该检测方法 可行[8]。
本文采用胶体金快速定量法、酶联免疫吸附法、时间分辨荧光免疫层析法及高效液相谱法检测同
*基金项目：莆田市科技计划项目（项目编号：2016N2011)
收稿日期：2018-05-29
作者简介：谢婷婷（1988-)，女，福建福州人，颂士，工程师，主要从事粮油饲料安全检测工作。
福建轻纺2018年9月第9期这M^
一批小麦及其制品中呕吐毒素，比较几种快速检测 方法的准确性、成本以及便携性等方面，以期为呕 吐毒素的快速检测提供参考。
1材料与仪器
1.1试验材料
随机选取小麦若干份。
1.2主要仪器
R O SA-M真菌快速检测仪：Charm Sciences公 司；
R O SA-FA ST5呕吐毒素快速试纸条：Charm Sciences公司；
呕吐毒素免疫亲和柱：北京华安麦科科技有限 公司；
高效液相谱：岛津LC-20A;
真菌毒素时间分辨荧光免疫层析检测仪：江苏 苏薇微生物研究有限公司；
电子天平：梅特勒-托利多AB204-L;
呕吐毒素标准品：美国Sigma公司；
甲醇：谱纯；
1.3试验方法
1.3.1分样
按照GB5491-1985《粮食、油料检验扦样、分 样法》的规定进行扦样、分样。
1.3.2除杂
按照G B/T5494-2008《粮油检验粮食、油料的杂质、不完善粒检验》的规定去除样品中的杂质。
1.3.3高效液相谱法测定小麦中呕吐毒素
按照GB 5009.111-2016《食品安全国家标准食 品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第2法免疫亲和层析净化高效液相谱法测定小麦中 呕吐毒素。
谱条件：C18柱（5p m，250m m X4.6m m);
流动相：V(甲醇）：V(水)=20 : 80;
流速：1.0mL/min；柱温：35 °C；进样量：50 ^L；检测波长：218nm。1.3.4胶体金快速定量法测定小麦中呕吐毒素
准确称取10.00 g试样于100 mL具塞锥形瓶中，加入50.0 m L试样提取液，密闭，用涡旋振荡器振荡 1〜2 min，静置后用滤纸过滤，或取1.0〜1.5mL混合液 于离心管中，4000 r/m in离心1min。取滤液或离心 后上清液100 p L于另一离心管中，加入1.0 mL稀释 缓冲液，充分混匀待测。
将检测条平放在45-孵育器凹槽中，打开加样 槽，准确移取300 p L待测溶液至检测条加样孔中，关闭孵育器盖。孵育5 min后，取出检测条观察质控 线和检测线的显情况，必须出现清晰齐整的质控 线即C线。若出现下述4种情况，视为检测条无效：⑴C线（质控线）不出现、弥散或严重不均匀；⑵ T1或T2线（检测线）严重不均匀；⑶待测溶液掩 盖或模糊了 T1、T2线或C线；（4)胶体金显微粒没有 通过T1、T2线或C线。谢杏芳个人资料
孵育完成后，选取读数仪呕吐毒素检测频道中 “基质00”（M ATRIX00)样品测定类型进行测定，读 数仪显示样品中呕吐毒素的含量。
1.3.5酶联免疫法测定小麦中呕吐毒素
准确称取5.0 g试样于具塞三角瓶中，准确加入 25.0 mL 60%甲醇水溶液，振荡20 min，以定性滤纸 快速过滤，收集滤液。取样品提取液1mL加水4 mL 混匀即得待测样液（稀释系数25)。
将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20〜25C)平衡1h以上，注意每种液体试剂使用前 均须摇匀。控制温度在20〜25 C。
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本 和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的 位置，加入标准品或样本50 p L到对应的微孔中，加 酶标物50 p L/孔，再加入抗试剂50 p L/孔，轻轻 振荡混匀，用盖板膜盖板后置25 C避光环境中反应 30 min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗漆 液250 p L /孔，充分洗涤4〜5次，每次间隔10 s，在 吸水纸上拍干。
谢婷婷，林秀，陈凌峰：小麦中呕吐毒素快速检测方法比较K m】
加入底物液100 ^L/孔，用盖板膜盖板后置25 °C 避光环境反应15 mm。加入终止液50 ^L/孔，轻轻 振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处（建议用双波长 450/630 nm检测），测定每孔OD值。
1.3.6时间分辨荧光免疫层析法测定小麦中呕吐毒素
准确称取2.0 g样品至50 mL离心管中，准确加入 20 mL水加盖，混匀。将离心管放置漩涡混匀器上涡 旋提取2 min，于离心机4000 r/mm离心5 min，得上 清液。
将时间分辨荧光免疫层析定量检测卡从冷藏柜 取出，平衡至室温后，将其平放，用移液器定量吸 取50 ^L上清液加入950 ^L呕吐毒素稀释液中，充 分混匀，吸取100 ^L此混合液垂直滴加于加样孔 中，于20〜25 C室温条件下进行反应，开始计时。反 应10 min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检 测仪中。读数完成后，自动计算待测样品中呕吐毒 素含量。若待测样品中呕吐毒素含量超过检测线性 范围，应使用提取液对其滤液进行稀释后，吸取 100 ^L加入稀释液中，重新进行读数。
1.3.7数据分析
应用Excel软件进行数据处理进行统计分析。
2结果与讨论
将高效液相谱法的测定结果作为认定值，3种 快速检测方法的测定结果与之比较，按以下公式进行计算。
正确度(％)=检测值/认定值x100%
2.1胶体金快速定量法
胶体金快速定量法检测小麦中呕吐毒素，其结 果与液相谱法测定的结果相对比，正确度范围在 102.9%~140.8%之间，平均为121.1%，结果见表1。胶 体金快速定量读数仪中内含标准曲线，只需校准，大大避免了试剂对操作人员的危害。此方法要求条 件低，操作简单，检测时间较短。与高效液相谱 法相比较，检测数据正确度也较高。
2.2酶联免疫法
酶联免疫法检测小麦中呕吐毒素，其结果与液 相谱法测定的结果相对比，正确度范围在92.6% -134.6%之间，平均为105.8% (表2)。
从上表可以看出，酶联免疫分析法作为传统的 小麦呕吐毒素筛选方法，其检测数据相对较准确，与高效液相谱法相比，差值较小。同时其检测数 据较为稳定，但是在操作过程，其要求的实验环境 温度等因素也相对较高一些。
2.3时间分辨免疫层析法
时间分辨免疫层析法检测小麦中呕吐毒素，其 结果与液相谱法测定的结果相对比，正确度范围 在93.9%-135.7%之间，平均为 108.0% (表3)。
从表3可以看出，与高效液相谱法相比，时间
表1胶体金快速定量法正确度分析
序号液相谱法（p p b )胶体金快速定量法（p p b )差值（p p b )正确度（％)平均值（％) 112201400180114.8
210801*********.6
39601300340135.4
417042000296117.4
59421200258127.4121.1 6906100094110.4
734003700300108.8
817752*********.8
98091000191123.6
1040804200120102.9
福建轻纺2018年9月第9期
表2酶联免疫法正确度分析
序号液相谱法（p p b )酶联免疫法（p p b )差值（p p b )正确度（％)平均值（％) 112201098.3-121.790.0
210801063.4-16.698.5
3960948-1298.8
417041767.963.9103.8
5942940-299.8105.8 6906838.8-67.292.6
734003547.6147.6104.3
817752388.5613.5134.6
98091048239129.5
1040804324.2244.2106.0
表3时间分辨免疫层析法正确度分析
序号液相谱法（p p b )时间分辨荧光免疫层析法（p p b )差值（p p b )正确度（％)平均值（％) 112201339119109.8
21080116989108.2
3960959.5-0.599.9
41704180096105.6
5942884.3-57.793.9108.0 6906100296110.6
734003561161104.7
81775180025101.4
98091098289135.7
1040804472392109.6
表4几种小麦呕吐毒素检测方法的检测时间、成本、试剂毒性比较
检测方法液相谱法酶联免疫法胶体金快速定量法时间分辨荧光免疫层析法检测时间（m i n )>1440852530
检测成本（元）>11001100500875试剂毒性大较大小小
对仪器操作难易程度较难容易容易容易是否可便携否否是是
分辨免疫层析法检测小麦中呕吐毒素的检测结果正 确度较高。在其操作的过程中，检验步骤简单，仪 器本身自带有标准曲线，减少了试剂毒性对人体的危害。
2.4检测时间、成本、毒性的比较
从表4可以看出，与传统的大型仪器方法（高效液相谱法）相比较，快速检测方法有其明显的优 势。对比检测时间、成本、毒性以及对操作人员的 要求这几方面，快速检测方法具有短时间、低成本、健康环保以及便携性等优点。其中，胶体金快速定 量法和时间分辨荧光免疫层析法是近年发展起来比 较实用的快速检测方法，它们在检测小麦中呕吐毒
谢婷婷，林秀，陈凌峰：小麦中呕吐毒素快速检测方法比较K m^
素所需的检测时间是相对较短的，其试剂毒性对操 作人员的影响也较小，操作简单，容易携带至现场 进行检测。
3结论
为了满足日益增长的粮食质量安全现场快速检 测的需求，粮食快速检测方法也越来越被人们关注。胶体金快速定量法、酶联免疫法和时间分辨荧光免 疫层析法这3种快速检测小麦呕吐毒素的方法，均具有良好的正确度，胶体金快速定量法和时间分辨荧 光免疫层析法这2种方法的仪器适用于直接携带至现 场进行快速筛查，成本较低，操作较为简单。酶联 免疫法虽然操作简单，但是受到仪器以及环境温度 的限制，更适用于进行初步筛查后的进一步确证。
在粮食收购期间，现场入库把关大量样品的快 速初筛可根据实际需要选择合适的快速检测方法，更能有效地完成粮食收购工作。
参考文献：
[1] 师邱毅，纪其雄，许莉勇.食品安全快速检测技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2010.
[2] 孙秀兰，邵景东，王俊双.粮油食品中呕吐毒素危害及风险分析粮食与油脂，20〇6(03):41-43.
[3] 王重庆.分子免疫学基础[M].北京：北京大学出版社，1"7.
[4] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理局.食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀
菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定:GB5009.111-2016[S].北京：中国标准出版社，2016:12.
[5] 尚艳娥.真菌毒素检测技术研究进展[J].北京工商大学学报(自然科学版)，2012(04):15-18.
[6] 张道宏，李培武，张奇，等.污染粮油食品的主要真菌毒素及胶体金免疫层析技术在快速检测中的应用[J].中国油料作
物学报，2010(04):577-582.
[7] 许艳丽，鲍蕾，吴振兴等.免疫胶体金技术及其在真菌毒素检测中的应用[J].中国酿造，2010(07):13-17.
[8] 谢婷婷.时间分辨荧光免疫层析法检测小麦中呕吐毒素的研究U].粮食与食品工业，2018 (03):61-63.
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