㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(２):２０~２９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０２.００３
收稿日期:２０２２－０５－２０
基金项目：山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０１９ＭＣ００３)ꎻ山东省农业良种工程项目(２０２１ＬＺＧＣ０２４)ꎻ国家现代苹果产业技术体系项目
(ＣＡＲＳ－２７)ꎻ青岛农业大学高层次人才科研基金资助项目(６６３/１１１８０１６)
作者简介：孙晓红(１９７０ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事红肉苹果分子育种与技术方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｍｉｎｇｓｕｎ９８８７＠１６３.ｃｏｍ
李欣欣(１９９６ )ꎬ女ꎬ硕士ꎬ主要从事苹果分子育种方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:２３９８８１５６２２＠ｑｑ.ｃｏｍ∗同为第一作者ꎮ
通信作者：张玉刚(１９７３ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事苹果分子生物技术与遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｇｚｈａｎｇ＠ｑａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
孙晓红１ꎬ２ꎬ李欣欣３∗ꎬ王彦博３ꎬ陈奕州３ꎬ张玉刚２ꎬ３
(１.青岛农业大学生命科学学院ꎬ山东青岛㊀２６６１０９ꎻ２.山东省园艺作物基因改良工程实验室ꎬ山东青岛㊀２６６１０９ꎻ
３.青岛农业大学园艺学院ꎬ山东青岛㊀２６６１０９)
㊀㊀摘要:ＭＫＫ９是丝裂原活化蛋白激酶(ＭＡＰＫ)家族重要成员之一ꎬ是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶ꎮ为深入研究苹果ＭＫＫ９的相关功能ꎬ以红肉苹果 黛红 为材料ꎬ克隆到ＭｄＭＫＫ９基因ＣＤＳ序列ꎬ利用酵母双杂交试验筛选苹果ｃＤＮＡ文库ꎬ并通过酵母双杂交筛选㊁体内双分子荧光互补(ＢｉＦＣ)和体外Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ试验进行ＭｄＭＫＫ９互作蛋白验证ꎮ结果表明ꎬ通过对苹果ｃＤＮＡ文库的筛选ꎬ共获得１１个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白ꎻ选取花青苷合成相关蛋白ＭｄＣＨＳ及氮胁迫调控相关蛋白ＭｄＳＰＸ３进行酵母双杂交㊁体内ＢｉＦＣ及体外Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ试验ꎬ结果证明ＭｄＭＫＫ９可与ＭｄＳＰＸ３互作ꎮ
关键词：红肉苹果ꎻＭｄＭＫＫ９ꎻ酵母双杂交ꎻ双分子荧光互补ꎻ互作蛋白
中图分类号:Ｓ６６１.１:Ｑ７８㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０２－
００２０－１０
ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｄＭＫＫ９ＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＲｅｄ￣ＦｌｅｓｈｅｄＡｐｐｌｅ
ＳｕｎＸｉａｏｈｏｎｇ１ꎬ２ꎬＬｉＸｉｎｘｉｎ３∗ꎬＷａｎｇＹａｎｂｏ３ꎬＣｈｅｎＹｉｚｈｏｕ３ꎬＺｈａｎｇＹｕｇａｎｇ２ꎬ３
(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐｓꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ
３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＭＫＫ９ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｍｉｔｏｇｅｎ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ(ＭＡＰＫ)ｆａｍｉｌｙꎬ
ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｌｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｅｘｔｅｒｎａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆａｐｐｌｅＭＫＫ９ꎬｔｈｅＭｄＭＫＫ９ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｅｄ￣ｆｌｅｓｈｅｄａｐｐｌｅ Ｄａｉｈｏｎｇ ꎬａｎｄｔｈｅａｐｐｌｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｙｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄｔｅｓｔ.ＴｈｅＭｄＭＫＫ９ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄ
ｂｙｙｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｉｎｖｉｖｏｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ(ＢｉＦＣ)ｔｅｓｔａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎｔｅｓｔ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｒｏｕｇｈｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙꎬａｔｏｔａｌｏｆ１１ｃａｎｄｉｄａｔｅｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｄｖｅｒｓｉｔｙｓｔｒｅｓｓｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ.Ｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＭｄＣＨＳａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＭｄＳＰＸ３ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｙｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄꎬｉｎｖｉｖｏＢｉＦＣａｎｄｉｎｖｉｔｒｏＰｕｌｌ￣ｄｏｗｎａｓｓａｙｓ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔＭｄＭＫＫ９ｃｏｕｌｄｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈＭｄＳＰＸ３.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｒｅｄ￣ｆｌｅｓｈｅｄａｐｐｌｅꎻＭｄＭＫＫ９ꎻＹｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄꎻＢｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ￣
ｔｉｏｎꎻＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ
㊀㊀丝裂原活化蛋白激酶(ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏ￣ｔｅｉｎｋｉｎａｓｅꎬＭＡＰＫ)级联信号系统是广泛存在于真核生物的信号传递系统ꎬ尤其在植物响应外界环境胁迫信号转导过程中发挥重要作用[１]ꎮＭＡＰＫ模块包括３种激酶ꎬ分别为ＭＫＫＫ㊁ＭＫＫ和ＭＡＰＫꎬ其中ＭＡＰＫＫｓ成员数量最少(拟南芥１０个[２]ꎬ番茄５个[３]ꎬ黄瓜６个[４])ꎬ可分为Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ４个亚族ꎬ另外ꎬ部分植物中也发现了ＭＡＰ￣ＫＫＫＫｓ的存在[５]ꎮ当植物受到辐射㊁病原体㊁干旱等外界信号刺激时ꎬＭＫＫＫ㊁ＭＫＫ和ＭＡＰＫ会改变静止状态ꎬ发生顺序的磷酸化反应ꎬ激活下游靶标基因ꎬ从而对植物生长发育㊁基因表达和环境适应等方面进行调控[６]ꎮ如拟南芥中４－甲氧基吲哚基－３－甲基硫代葡萄糖苷的生物合成和积累ꎬ为其硫代葡萄糖苷响应非生物胁迫提供了ＭＡＰＫ介导的信号通路[７]ꎻＭＫＫ９是ＭＡＰＫ级联信号途径ＭＫＫｓ中Ｄ亚族的重要成员ꎬ在拟南芥中响应低氮㊁低磷胁迫从而调控花青苷的合成[８ꎬ９]ꎻ棉花中ＧｈＭＫＫ９与ＧｈＲａｆ１９存在互作关系ꎬ参与棉花抗枯萎病的生物过程[１０]ꎻ拟南芥的ＭＫＫ９－ＭＰＫ６级联系统通过调控ＲＣＡ㊁Ｆｔｓｚ２－２㊁ＴＯＲ２和ＰＲＰＳ１的磷酸化在响应盐胁迫中发挥作用ꎬ轻度盐渗透胁迫能够激活ＭＫＫ９－ＭＡＰＫ３/６级联
信号系统[１]ꎻＭＫＫ９作为盐处理拟南芥愈伤组织积累Ｈ２Ｏ２的正因子ꎬ与ＭＡＰＫ３/６形成信号通路增强细胞的呼吸作用[１１]ꎻＭＫＫ９－ＭＡＰＫ３/６级联反应能够促进拟南芥幼苗对磷的吸收[１２]ꎻＲＡＦ２２－ＭＫＫ７/ＭＫＫ９－ＭＰＫ３/ＭＰＫ６形成一个完整的级联过程ꎬ通过参与蔗糖分解代谢来调控拟南芥的生长[１３]ꎻ磷脂酸(ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄꎬＰＡ)能够同时结合ＭＰＫ６和ＭＫＫ９ꎬ增强ＭＫＫ９对ＭＰＫ６的磷酸化活性[１４]ꎻＭＫＫ９的组成型和诱导型过表达导致拟南芥叶片过早衰老ꎬ敲除ＭＫＫ９后叶片则延迟衰老[１５]ꎻ拟南芥ＭＫＫ９通过调节花青素积累和氮状态来调节植物对低氮胁迫的适应[８]ꎮ但苹果中ＭｄＭＫＫ９生物学功能研究尚少ꎬＭｄ￣ＭＫＫ９互作蛋白的研究未见报道ꎮ本研究通过对红肉苹果ｃＤＮＡ文库的筛选得到ＭｄＭＫＫ９互作蛋白ꎬ选取与花青苷合成和氮调控相关蛋白ꎬ利用酵母双杂交㊁体内双分子荧光互补(ＢｉＦＣ)和体外Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ试验进行互作蛋白验证ꎬ以期为今后预测ＭｄＭＫＫ９在花青苷积累和氮胁迫响应方面的功能提供参考ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀试验材料与试剂、仪器
供试材料为红肉苹果 黛红 ꎬ种植于青岛农业大学胶州现代农业示范园ꎮ
大肠杆菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)ＤＨ５α感受态㊁大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态㊁酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ￣ａｅ)Ｙ２ＨＧｏｌｄ感受态ꎬ购于上海唯地生物技术有限公司ꎻｐＧＡＤＴ７文库质粒及ｐＧＢＫＴ７㊁ｐＧＡＤＴ７㊁ｐＧＢＫＴ７－５３(对照载体)㊁ｐＧＡＤＴ７－Ｔ㊁ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ㊁ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｎＬＵＣ㊁ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｃＬＵＣ㊁ｐＥＴ－３２ａ㊁ｐＧＥＸ－４Ｔ－１载体均为实验室保存ꎮ
ＳＤ缺陷培养基㊁ＹＰＤＡ培养基㊁Ｘ－α－ｇａｌ㊁ＡｂＡ购于ＴａＫａＲａꎮ
ＰＣＲ仪(ＴａＫａＲａＴＰ－６００)㊁植物活体荧光仪㊁电泳仪(Ｂｉｏ－ＲａｄＰｏｗｅｒＰａｃ－３０００)㊁凝胶成像系统㊁恒温培养箱及摇床等ꎮ
１.２㊀试验方法
１.２.１㊀ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９诱饵表达载体构建㊀把本实验室前期扩增得到的ＭｄＭＫＫ９基因的ＣＤＳ区域(ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＯＮ４２７８２０)重组到ｐＧＢＫＴ７载体的ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ之间ꎬ构建诱饵表达载体ꎬ命名为ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９ꎮ１.２.２㊀诱饵质粒细胞转化效率和毒性检测及ＡｂＡ(金担子素)浓度筛选㊀参照ＹｅｓｔｍａｋｅｒＴＭＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ２ＵｓｅｒＭａｎｕａｌ中菌落数要求ꎬ根据公式计算转化效率ꎮ通过比对ｐＧ￣ＢＫＴ７空载和ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９在ＳＤ－Ｔｒｐ板上酵母菌落生长状况检测诱饵质粒毒性ꎮ通过对ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９自激活检测筛选适宜的ＡｂＡ浓度ꎮ
１.２.３㊀酵母文库双杂交㊀按照ＭａｔｃｈｍａｋｅｒＧｏｌｄＹｅａｓｔＴｗｏ－ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍ操作说明进行酵母文库双杂交ꎮ将转化好的杂交菌液涂布于直径１５０
１２
㊀第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀孙晓红ꎬ等：红肉苹果ＭｄＭＫＫ９互作蛋白的筛选与鉴定
ｍｍ的ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ培养基平板上ꎬ３０ħ倒置培养３~４ｄꎮ将ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ培养基上有明显生长优势的单克隆菌落ꎬ用灭菌头划线于ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ/ＡｂＡ/Ｘ－α－ｇａｌ培养基上ꎬ３０ħ倒置培养２~３ｄꎬ得到蓝菌斑ꎮ挑取蓝明显单菌落ꎬ加入１０μＬｄｄＨ２Ｏ均匀稀释进行阳性克隆筛选ꎬ利用引物ｐＧＡＤＴ７－Ｆ/ｐＧＡＤＴ７－Ｒ进行ＰＣＲ扩增ꎬ将只扩增出一条带的菌液进行测序ꎬ测序结果利用ＮＣＢＩ数据库及苹果基因组数据库对可能互作的相关蛋白编码基因进行注释分析ꎮ
１.２.４㊀ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＣＨＳ㊁ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＳＰＸ３载体构建㊀根据ｐＧＡＤＴ７载体图谱及ＭｄＣＨＳ㊁Ｍｄ￣ＳＰＸ３基因序列设计分别含ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ及ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的引物ꎮ将双酶切的载体与基因产物１６ħ连接并过夜ꎮ连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态ꎬ挑取Ｋａｎ抗性板上的单克隆摇菌ꎬ菌液经交叉引物ＰＣＲ筛选后进行测序ꎮ将构建的载体分别命名为ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＣＨＳ和ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＳＰＸ３ꎮ
１.２.５㊀酵母双杂交验证ＭｄＭＫＫ９与ＭｄＣＨＳ㊁Ｍｄ￣ＳＰＸ３互作情况㊀将Ｂａｉｔ质粒ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９与Ｐｒｅｙ质粒ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＣＨＳ㊁ｐＧＡＤＴ７－ＭｄＳＰＸ３共转Ｙ２ＨＧｏｌｄ感受态细胞ꎬ并涂布在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ培养基上ꎬ３０ħ培养３~５ｄꎻ分别设置阳性(ｐＧＢＫＴ７－５３＋ｐＧＡＤＴ７－Ｔ)与阴性(ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ＋ｐＧＡＤＴ７－Ｔ)对照ꎬ分别挑取对照组与试验组培养基上的单菌落ꎬ用灭菌ｄｄＨ２Ｏ稀释１０倍ꎬ取８μＬ点于ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ/Ｘ－α－ｇａｌ/ＡｂＡ培养基上ꎬ观察菌落颜变化ꎮ
１.２.６㊀ＢｉＦＣ载体构建及体内蛋白互作验证㊀将无ＭｄＭＫＫ９终止密码子的ＯＲＦ区域克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｎＬＵＣ载体中ꎬ并将ＭｄＳＰＸ３克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｃＬＵＣ载体上ꎬ将两种重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ送公司测序成功后ꎬ转化根癌农杆菌ＧＶ３１０１ꎮ菌液于２８ħ摇至ＯＤ６００为０.５~０.８ꎬ离心后用重悬液重悬ꎬ将ｎＬＵＣ－Ｍｄ￣ＭＫＫ９＋ｃＬＵＣ－ＭｄＳＰＸ３作为试验组㊁ｎＬＵＣ－Ｍｄ￣ＭＫＫ９＋ｃＬＵＣ作为对照组ꎬ注射本生烟ꎬ培养２~３ｄꎬ使用活体荧光仪检测ＬＵＣ表达情况ꎮ１.２.７㊀Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ载体构建及体外蛋白互作验证㊀(１)原核表达载体构建及重组蛋白诱导表达：将ＭｄＭＫＫ９克隆到ｐＧＥＸ－４Ｔ－１载体㊁ＭｄＳＰＸ３克隆到ｐＥＴ－３２ａ载体上ꎬ构建ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＧＳＴ－ＭｄＭＫＫ９(ＧＳＴ－ＭｄＭＫＫ９)和ｐＥＴ－３２ａ－ＨＩＳ－Ｍｄ￣ＳＰＸ３(ＨＩＳ－ＭｄＳＰＸ３)载体ꎮ将重组质粒转入大肠杆菌ＢＬ２１ꎬ测序成功后提取质粒ꎬ转化ＤＥ３大肠杆菌ꎮ
苹果13粉版多被男性购买菌液在３７ħ培养至ＯＤ６００为０.５~０.８时ꎬ加入２００ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ(异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷)进行诱导ꎬ３０ħ继续摇菌６ｈꎮ分别于摇菌２㊁４㊁６ｈ各取１ｍＬ菌液作为阳性对照ꎬ取诱导前菌液１ｍＬ作为阴性对照(０ｈ)ꎮ在离心管中加入０.２ｍｏｌ/ＬＰＭＳＦ(苯)８０μＬꎬ用超声波破碎菌液ꎮ超声波破碎条件：工作时间５ｓꎬ间歇１０ｓꎬ功率３５％ꎬ６０~７０ｍｉｎꎬ４ħꎮ破碎后的菌液于４ħ㊁５０００ｒ/ｍｉｎ离心１５ｍｉｎꎬ分离上清和沉淀ꎬ用ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ＝７.４)重悬沉淀ꎬ用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对上清和沉淀分别进行检测ꎮ(２)重组蛋白纯化：分别对诱导的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＧＳＴ－ＭｄＭＫＫ９(ＧＳＴ－ＭｄＭＫＫ９)/ｐＥＴ－３２ａ－ＨＩＳ－ＭｄＳＰＸ３(ＨＩＳ－ＭｄＳＰＸ３)蛋白使用Ｐｉｅｒｃｅ试剂盒纯化ꎬ过柱子后洗脱蛋白ꎮ加上ＧＳＴ/ＨＩＳ标签的纯化蛋白用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ꎮ(３)Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ验证互作:Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ试验步骤同上ꎬ将诱导的ＨＩＳ－ＭｄＳＰＸ３融合蛋白与ＧＳＴ－ＭｄＭＫＫ９融合蛋白按照１ʒ１比例混合ꎬ过带有ＨＩＳ活化柱料的蛋白过滤柱ꎬ洗脱蛋白用于Ｗｅｓｔ￣ｅｒｎｂｌｏｔ检测ꎮ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ跑胶后转ＰＶＤＦ膜ꎬ将转后的ＰＶＤＦ膜分别放入封闭液封闭２~３ｈ㊁放入含ＧＳＴ抗体的一抗抗体反应液孵育过夜及放入二抗抗体反应液孵育２~３ｈꎬ最后加入超敏化学发光试剂盒显液进行蛋白显影ꎮ
１.２.８㊀本研究所用引物名称及序列㊀研究中进行克隆基因㊁构建载体等工作所需的引物及其序列见表１ꎮ
２２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
㊀㊀表１㊀
所用引物名称㊁序列㊁酶切位点及功能
引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)
内切酶引物用途ＭｄＭＫＫ９－ＦＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＣＧＴＧ
ＥｃｏＲⅠ
ＭｄＭＫＫ９－ＲＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＣＢａｍＨⅠＰＣＲ扩增ＭｄＣＨＳ－ＦＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＴＮｄｅⅠ
ＭｄＣＨＳ－ＲＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＣＡＣＧＣ
ＥｃｏＲⅠＰＣＲ扩增ＭｄＳＰＸ３－Ｆ
ＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＮｄｅⅠＭｄＳＰＸ３－ＲＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＢａｍＨⅠＰＣＲ扩增ＡＤ－ＳＰＸ３－ＦＣＡＴＡＴＧＡ
ＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＮｄｅⅠＡＤ－ＳＰＸ３－ＲＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＢａｍＨⅠ酵母双杂交ＡＤ－ＣＨＳ－ＦＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＴＮｄｅⅠＡＤ－ＣＨＳ－ＲＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＣＡＣＧＣＥｃｏＲⅠ酵母双杂交ｐＧＡＤＴ７－Ｆ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧｐＧＡＤＴ７－ＲТТТТСＧТТТТААААССТААＧАＧТСＰＣＲ筛选ＢＤ＋ＭＫＫ９－Ｆ
ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧ
ＥｃｏＲⅠＢＤ＋ＭＫＫ９－ＲＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＣＴＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＢａｍＨⅠ酵母双杂交ｎＬＵＣ－ＭＫＫ９－Ｆ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧ
ＢａｍＨⅠｎＬＵＣ－ＭＫＫ９－ＲＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡＧＧＡｃｃⅠＢｉＦＣ载体构建ｃＬＵＣ－ＳＰＸ３－ＦＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＫｐｎⅠｃＬＵＣ－ＳＰＸ３－ＲＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＡａｔⅡ
ＢｉＦＣ载体构建ＧＳＴ－ＭＫＫ９－ＦＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＢａｍＨⅠＧＳＴ－ＭＫＫ９－ＲＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡｃｃⅠ原核表达载体构建ＨＩＳ－ＳＰＸ－ＦＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴ
ＡｃｃⅠＨＩＳ－ＳＰＸ－Ｒ
ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧ
ＢａｍＨⅠ原核表达载体构建
㊀㊀注：引物序列中下划线部分是限制性内切酶酶切位点ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９载体构建及诱饵质粒细
胞毒性检测
将红肉苹果 黛红 的ＭｄＭＫＫ９基因产物连接到酵母双杂交诱饵载体ｐＧＢＫＴ７中ꎬ得到ｐＧ￣ＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９重组质粒ꎮ将ｐＧＢＫＴ７和ｐＧ￣ＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ鉴定结果
证明ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９成功转化(图１Ａ)ꎮ参照ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓ￣
ｔｅｍ２ＵｓｅｒＭａｎｕａｌ中菌落数要求ꎬ选择菌落数在
３０~３００个范围的ＳＤ－Ｔｒｐ平板来计算诱饵质粒细胞转化效率ꎬ根据转化效率计算公式得到最终转化效率为６ˑ１０４个转化子ꎮ通过比对ｐＧＢＫＴ７空载和ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９在ＳＤ
－Ｔｒｐ板上酵母菌落生长状况证实ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９并无毒性(图１Ｂ)ꎮ
Ａ:ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９重组子胶图ꎻＢ:ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９毒性检测ꎮ
Ｍ:ＳｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒꎻ１㊁２:ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９质粒ꎮ(ａ):ＳＤ－Ｔｒｐ培养基诱饵质粒的酵母菌落ꎻ
(ｂ)：在ＳＤ－Ｔｒｐ培养基中ꎬｐＧＢＫＴ７空载生长ꎻ(ｃ)：在ＳＤ－Ｔｒｐ培养基中ꎬｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９生长ꎮ
图１㊀ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９载体构建及诱饵质粒细胞的毒性检测
３
２㊀第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀孙晓红ꎬ等：红肉苹果ＭｄＭＫＫ９互作蛋白的筛选与鉴定
２.２㊀诱饵质粒细胞自激活检测及ＡｂＡ抗性浓度
筛选
通过对ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９自激活检测发现转化ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９诱饵质粒的Ｙ２ＨＧｏｌｄ酵母细胞能够在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ(２００ｎｇ/μＬ)上正常生长(图２Ａ)ꎬ证明诱饵质粒具有自激活能力ꎮ通过ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９质粒在不同浓度ＡｂＡ上的生长筛选结果显示ꎬｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９在３００ｎｇ/μＬ和４００ｎｇ/μＬＡｂＡ上均没有酵母单
菌落生长(图２Ｂ)ꎬ所以后续试验选择３００ｎｇ/μＬＡｂＡ进行文库筛选ꎮ
制作ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９酵母感受态ꎬ共转文
库质粒ꎬ涂布在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ培养基上ꎮ２~３ｄ后选取生长明显的单菌落(图２Ｃ)作为阳性克隆ꎬ划线于ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ/Ｘ－α－ｇａｌ/ＡｂＡ培养基上ꎬ融合蛋白表达激活半乳糖苷酶活性ꎬ使得酵母菌落在含有Ｘ－α－ｇａｌ的培养基上显蓝(图
２Ｄ)ꎮ
Ａ:ｐＧＢＫＴ７－ＭｄＭＫＫ９在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ(２００ｎｇ/μＬ)自激活检测ꎻＢ:ＡｂＡ抗性浓度筛选ꎻ
Ｃ:ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ筛选阳性克隆ꎻＤ:ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ/Ｘ－α－ｇａｌ/ＡｂＡ板筛选蓝菌斑ꎮ
(ａ):ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕꎻ(ｂ):ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ(３００ｎｇ/μＬ)ꎻ(ｃ):ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ/ＡｂＡ(４００ｎｇ/μＬ)ꎮ
图２㊀诱饵质粒细胞自激活检测及ＡｂＡ抗性浓度筛选
２.３㊀互作蛋白的功能注释
将ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ/Ｘ－α－ｇａｌ/ＡｂＡ培养基上筛选的蓝菌斑进行ＰＣＲ分析ꎬ选取单片段插入菌斑进行测序ꎬ获得１１条读码框完整的
ｃＤＮＡ序列ꎬ通过与ＮＣＢＩ数据库进行比对ꎬ获取每条序列登录号㊁蛋白名称及功能(表２)ꎬ并根据实验目的选择花青苷合成相关蛋白ＣＨＳ及氮素调控相关蛋白ＳＰＸ３进行蛋白互作验证ꎮ
㊀㊀表２㊀
互作蛋白及功能注释
序号登录号蛋白名称
功能
１
ＸＭ＿００８３８２５３４.３
生长素反应蛋白ＳＡＵＲ７８
过表达生长素响应基因ＴａＳＡＵＲ７８能够上调转基因拟南芥株系中抗逆相关基因的表达量ꎬ减少细胞内过氧化氢的积累ꎬ提高转基因拟南芥对盐㊁旱和低温胁迫的耐受能力ꎻ通过调控ＴａＶＤＡＣ１提高植物对逆境的耐受能力
２ＸＭ＿００８３４３７４１.３转录因子ＭＹＣ２
ｂＨＬＨ转录因子ＭＹＣ２通过调节脯氨酸的生物合成使拟南芥产生耐盐性
３ＮＭ＿００１３２８８２６.１ＡＢ２９０７２８.１顶生花２蛋白的ＭｄＬＨＰ１ｂｍＲＮＡ
开花基因ＬＨＰ１通过抑制ｍｙｃ２依赖的免疫分支来调控拟南芥的应激反应
４ＸＭ＿００８３３９８１７.３蛋白质ＦＡＲ１相关序列５ＦＡＲｌ是一类起源于转座子酶的转录因子ꎬ在光敏素Ａ信号通路启动㊁植物光形态建成中具有重要作用
５ＸＭ＿０２９０９１８１３.１ＣＯＰ１相互作用蛋白７
蓝光抑制ＣＯＰ１/ＳＰＡＥ３泛素连接酶活性的分子机制ꎻ光照通过ＣＯＰ１控制雄蕊的伸长６
ＮＭ＿００１３１９２５７.１ＡＢ０７４４８５.１
聚酮合成酶５/查尔酮合成酶ＭｄＣＨＳｍＲＮＡ
花青苷合成相关
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