㊃论著㊃
基金项目：河北省中医药管理局科学技术研究计划项目
中西
医结合在中晚期自身免疫性肝病中的价值(2019492
王晓玲，沈丽贤，李惠文，张亚芹，李 瑶，吴书娜
(河北中医肝病医院二病区，河北石家庄050800
) 摘 要：目的 探讨外周血浆细胞样树突状细胞(p
D C s )在急性乙型肝炎(A H B )患者临床转归中的变化及作用㊂方法 纳入2015年6月至2017年5月收治的急性乙型肝炎(A H B 组)患者40例，给予退黄㊁降酶㊁保肝等药物，并加用恩替卡韦0.5m g 空腹口服,
1次/d ㊂另纳入健康体检者26例为健康对照组(H C 组)㊂H C 组于体检当天㊁A H B 组于前及后
6周采集外周静脉全血，采用E L I S A 法检测2组血浆H B VD N A ㊁H B s A g ㊁H b e A g 及肝功能指标水平，并应用流式细胞仪检测p D C s 的频数及其功能分子C D 86的表达水平㊂结果 6周后,A H B 组临床症状显著
缓解，血清学指标和乙型肝炎标志物水平显著下降(P <0.
01)㊂6周后,A H B 组H B V D N A 转阴率为82.5%,H B s A g 清除率为72.5%,H B e A g 血清学转换率为7
5.0%，与前比较差异均有统计学意义(P <0.01),H C 组p
D C s 频数显著高于A H B 组前㊂A H B 组后C D 86+p D C s 显著高于前㊂H C 组C D 86A B C 显著低于A H B 组前㊂结论 在急性乙型肝炎患者外周血p D C s 的数量降低㊂急性乙型肝炎患者在后C D 86+p D C s 增多㊂急性乙型肝炎患者p D C s 上C D 86表达上调㊂
关键词：乙型肝炎病毒；树突细胞；免疫反应中图分类号:R 373.21 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2020)08-0719-05
d o i :10.3969/j
.
i s s n .1004-583X.2020.08.010C h a n g e s a n d s i g n i f i c a n c e o fC D 86e x p r e s s i o no n p D C s i n p a t i e n t sw i t ha c u t e h e p
a t i t i sB W a n g X i a o l i n g ,S h e nL i x i a n ,L iH u i w e n ,Z h a n g Y a q
i n ,L iY a o ,W uS h u n a S e c o n d W a r d ,H e b e iH e p a t o p a t h y H o s p i t a l o f T C M ,S h i j i a z h u a n g 0
50800,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :S h e nL i x i a n ,E m a i l :f
r a n k .641@163.c o m A B S T R A C T :O b j e c t i v e T o e x p l o r e t h e c h a n g e s a n d f u n c t i o n s o f p l a s m a c y t o i dd e n d r i t i c c e l l s (p D C s )i n p e r i p h e r a l b l o o do f p a t i e n t sw i t ha c u t e h e p a t i t i sB (A H B )i n c l i n i c a l o u t c o m e .M e t h o d s T o t a l l y 40A H B p a t i e n t s (A H B g r o u p
)w e r e s e l e c t e d f r o mJ u n e 2015t o M a y 2017.T h e y w e r e t r e a t e dw i t hd r u g s t or e l i e v e j a u n d i c e ,r e d u c e e n z y m e a c t i v i t y
a n d p r o t e c t l i v e r .T h e y w e r e a l s o g i v e n 0.5m g o r a l e n t e c a v i r o n a n e m p t y s t o m a c ho n c e a d a y .A n d 26h e a l t h yp e o p
l e w e r e s e l e c t e d a s h e a l t h c o n t r o l g r o u p (H C g r o u p ).T h ew h o l e b l o o d s a m p l e sw e r e o b t a i n e d f r o m A H B g r o u p s i xw e e k s b e f o r e a n da f t e r t h e t r e a t m e n t ,a n d f r o m H C g r o u p a t t h e t i m eo fm e d i c a l e x a m i n a t i o n ,r e s p e c t i v e l y
.E L I S A m e t h o d w a s u s e d t od e t e c t t h e l e v e l s o fH B VD N A ,H B s A g ,H B e A g a n d l i v e r f u n c t i o n i n d e x e s ,a n d f l o wc y t o m e t r y w
a s u s e d t od e t e c t t h e f r e q u e n c y o f p D C s a n d t h e e x p
r e s s i o n l e v e l o fC D 86.R e s u l t s A f t e r s i xw e e k so f t r e a t m e n t ,t h e c l i n i c a l s y m p t o m s o fA H B g r o u p w e r es i g n i f i c a n t l y r e l i e v e d ,a n dt h e l e v e l so f s e r o l o g i c a l i n d i c a t o r sa n dh e p a t i t i sB m a r k e r s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d (P <0.01).T h en e g
a t i v ec o n v e r s i o nr a t i oo fH B V D N Ai n A H B p a t i e n t sw a s82.5%,t h e c l e a r a n c er a t eo f H B s A g w a s72.5%,a n dt h es e r o l o g i c a lc o n v e r s i o nr a t eo f H B e A g w a s75.0%.T h e r e w e r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s
b e f o r e a n d a f t e r t h e t r e a t m e n t (P <0.01).T h e f r e q u e n
c y o f p D C s i nH C g r o u p w a s h i g h e r t h a n t h a t i nA H B g r o u p b e f o r e t h e t r e a t m e n t .T h e e x p
r e s s i o n l e v e l o f C D 86o n p D C s i nA H B p a t i e n t s a f t e r t h e t r e a t m e n tw a sh i g h e r t h a nb e f o r e .C D 86A B Ci n H C g r o u p w a so b v i o u s l y l o w e r t h a nt h a t i n A H B g r o u p b e f o r et h e t r e a t m e n t .C o n c l u s i o n T h ef r e q u e n c y o f p D C si n p e r i p h e r a lb l o o dd e c r e a s e di n A H B g r o u p .T h eC D 86o n p D C s i n c r e a s e d i nA H B p a t i e n t s a f t e r t h e t r e a t m e n t .T h e e x p r e s s i o no fC D 86o n p D C s i nA H B p a t i e n t sw a su p -r e g u l a t e d .K E Y W O R D S :h e p a t i t i sBv i r u s ;d e n d r i t i c c e l l s ;i mm u n o r e a c t i o n 据世界卫生组织(WHO )统计，全球约有3.5亿
慢性乙型肝炎病毒(h e p
a t i t i sBv i r u s ,H B V )感染者，大大增加了肝硬化和肝癌的发生概率㊂人体的免疫反应与H B V 的相互作用对宿主的临床结局起
着决定性作用，病毒清除需要辅助性T 细胞(T h e l p e r ,T h )和细胞毒性淋巴细胞(c y
t o t o x i c l y m p h o c y
t e ,C T L )的激活，发挥有效作用㊂有学者认为,H B V -特异性T 细胞的功能缺陷让H B V 感染
慢性化[1]
，其功能缺陷的原因仍不是很清楚㊂作为
重要的抗原提呈细胞(a n t i g e n p r e s e n t i n g c e l l s ,A P C )，树突状细胞(d e n d r i t i c c e l l s ,D C )
能有效激活T 细胞反应，对临床结局起重要作用，尤其是H B V
㊃
917㊃‘临床荟萃“ 2020年8月20日第35卷第8期 C l i n i c a l F o c u s ,A u g
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感染初期[2-4]㊂D C分为髓样D C(m D C)和浆细胞样D C(p D C):m D C主要发挥抗原提呈作用;p D C则可以产生大量Ⅰ型干扰素(i n t e r f e r o n-Ⅰ,I F N-Ⅰ)，协助激活固有免疫反应和适应性免疫反应，在抗H B V 免疫反应中起着中枢性的作用[5-7]㊂外周血p D C s在慢性乙型肝炎(c h o r n i ch e p a t i t i sB,
C H B)患者中虽然数量没有改变，但表型和功能均有受损[8]㊂有关p D C s在急性乙型肝炎(a c u t eh e p a t i t i sB,A H B)患者中的变化及作用研究较少，其具体作用机制尚不清楚㊂D C细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例很小，其发挥免疫作用主要是通过分泌Ⅰ型干扰素或细胞因子,D C在适应性免疫过程中作为抗原提呈细胞，活化T淋巴细胞参与抗病毒过程㊂D C与N K细胞之间还同时存在相互作用[9]，即N K细胞调节D C 的分化方向,D C分泌细胞因子促进N K细胞活化㊂本研究纳入A H B患者40例，采用酶联免疫方法及细胞流式技术进行研究，旨在探讨p D C s在A H B患者临床转归中的变化及作用，现总结报道如下㊂
1资料与方法
1.1研究对象2015年6月-2017年5月于医院就诊的急性乙型肝炎(A H B)患者40例，男12例，女28例，年龄21~71岁，平均(59.5ʃ7.1)岁㊂①诊断标准：参考‘病毒性肝炎防治方案“[7]，患者感染H B V前(>6月)无乙型肝炎病史，感染后出现A H B 临床症状,H B s A g阳性㊁H B V-D N A阳性㊁H B c-I g M 阳性㊁肝功能异常㊂②纳入标准：患者年龄18~75岁，性别不限，诊断符合A H B诊断标准，首次确诊病例，未接受过抗病毒药物及免疫，患者依从性好，能完成相关检查㊂③排除标准：年龄<18岁或>75岁，合并其他病毒性肝炎,H I V感染，药物性㊁酒精性及自身免疫性肝炎，合并其他系统器官严重疾病，合并肿瘤㊁免疫相关疾病等，合并精神疾病或癫痫，妊娠期或哺乳期女性，依从性差，不能完成全部检查项目㊂另纳入基线资料匹配的同期健康体检者26例为健康对照组(h e a l t hc o n t r o l,H C)，其中男6例，
女20例，年龄24~71岁，平均(55.2ʃ6.3)岁㊂2组受试者性别㊁年龄等基本临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性㊂本研究经医院伦理委员会审批通过，全部受试者均知情同意并签署知情书㊂
1.2方法 A H B患者入院确诊后均嘱其充分休息㊁合理饮食㊁适当增加营养，并根据病情给予退黄㊁降酶㊁保肝等对症，改善肝脏微循环，促肝细胞生长素，部分患者给予人血白蛋白注射液等对症支持处理，预防患者病情重症化或慢性化，综合病情给予核苷类似物，全部患者应用恩替卡韦分散片(江苏正大天晴药业股份有限公司生产)0.5m g空腹口服,1次/d㊂
1.3检测指标与方法健康体检者在体检当日清晨㊁A H B患者在住院次日及6周后清晨空腹抽取静脉血5m l，应用贝克曼库尔特离心机以2000r/ m i n离心5m i n，取上清液，置于-70ħ冰箱保存待测，由检验科医师按试剂盒操作说明书进行各项指标检测㊂
1.3.1 H B V D N A㊁H B s A g㊁H B e A g及肝功能检测取血液标本2m l,H B V D N A定量检测采用荧光定量P C R法，在P C R反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个P C R进程，再通过标准曲线对未知模板进行定量分析，试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司㊂H B s A g㊁H b e A g等乙型肝炎标志物采用电化学发光法(E C L)进行定量检测, H B s A g正常参考值0~0.08I U/m l,H b e A g正常参考值0~1S/C O，试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，应用E l e c-s y s2010电化学发光免疫分
析仪进行检测㊂并根据前后检测结果计算H B V D N A转阴率㊁H B s A g清除率㊁H B e A g血清学转换率㊂
1.3.2外周血p D C s检测取血样标本200μl分别加入L i n1-F I T C3μl,H L A-D R-P e r C P3μl, C D123-A P C3μl,C D86-P E5μl，室温避光染，加入红细胞裂解液，应用P B S缓冲液洗涤细胞2次，参照试剂盒说明书加入荧光标记的相应抗体(均购自美国R D公司)，避光结合30m i n后，置于冰上待检㊂使用M D L-F l o w流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司生产)完成检测，利用微球定量，根据流式细胞仪测定时制作的标准曲线，计算出p D C s表面C D86分子的绝对计数(C D86A B C)㊂全部过程严格按照试剂盒说明进行操作㊂
1.4统计学方法应用S A S5.0软件进行统计分析㊂对计量数据进行正态性检验，符合正态分布的计量数据以均数ʃ标准差(x-ʃs)表示，组间两两比较采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1 A H B患者前后肝功能指标比较6周后,A H B患者肝功能指标明显改善，与前比较，差异均有统计学意义(P均<0.01)，见表1㊂
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表1 A H B 患者前后肝功能指标比较(x -ʃs
)检查时间例数A L T (U /L )
A S T (U /L )
T B I L (μm o l /L )D B I L (μm o l /L )前401126.80ʃ927.92642.93ʃ746.6175.24ʃ84.1057.32ʃ67.69后
40
520.40ʃ95.51
201.11ʃ9.85
38.21ʃ6.48
35.20ʃ5.51
t 值15.0112.758.83
7.53
P 值
0.000
0.000
0.0000.0002.2 A H B 患者前后乙型肝炎标志物水平比较 6周后,A H B 患者乙型肝炎标志物水平明显下降，与前比较，差异均有统计学意义(P <
0.01
)，见表2㊂表2 A H B 患者前后乙型肝炎标志物水平比较(x -ʃs
)检查时间例数H B V D N A (l o g 10I U /m l )H b s A g
(l o g 10I U /m l )H b e A g
(S /C O )
前404.64ʃ1.342.64ʃ1.38168.77ʃ74.65后
40
1.58ʃ0.080.92ʃ0.4123.28ʃ6.53
t 值3.85
2.97
8.24
P 值
0.0070.0090.0002.3 H B V D N A 转阴率㊁H B s A g 清除率㊁H B e A g 血
清学转换率变化 6周后,A H B 患者H B V D N A 转阴率为82.5%,H B s A g 清除率为7
2.5%,H B e A g 血清学转换率为7
5.0%，与前比较，差异均有统计学意义(P <0.01
)，见表3㊂2.4 外周血p D C s 频数比较 前H C 组与
A H
B 组外周血单个核细胞(P B M
C )
比较差异无统计学意义，而A H B 组后P B M C 频数显著低于前㊂H C 组外周血p D C s 频数显著高于A H B 组前，而A H B 组后与前p D C s 频数比较差异无统计学意义，见图1㊂
表3 A H B 患者后H B VD N A 转阴率㊁H B s A g 清除率㊁
H B e A g 血清学转换率比较[
例(%)]检查时间例数H B V D N A (+)H b s A g (+)H b e A g (+)前4040(100)
40(100
)40(100
)后40
7(17.5)11(27.5)10(25.0)χ2
值
8.21
7.56
7.88
P 值
0.0030.0090.0062.5 C D 86+p D C s 频数比较 前H C 组与
A H
B 组
C
D 86+p D C s 频数比较，差异无统计学意义,A H B 组后C D 86+p D C s 频数显著高于
前㊂H C 组C D 86A B C 显著低于A H B 组前,
而A H B 组后与前C D 86A B C 差异无统计学意义，见图2
㊂
图1 H C 与A H B 组前后P B M C 和p D C s 的频数 H C .健康对照组,0.A H B 组前,6.A H B 组6
周后
图2 H C 与A H B 组前后C D 86+p D C s 与C D 86A B C 水平 H C .健康对照组,0.A H B 组前,6.A H B 组6周后
㊃
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3讨论
急性乙型肝炎多数呈自限性过程，预后一般良好，临床上一般无需抗病毒，但仍有5%~10%的患者会发展为慢性乙型肝炎，导致病情迁延，影响患者预后㊂因此对可能会演变为慢性乙型肝炎的A H B患者应及时进行抗病毒及免疫调节，以减少其转变为慢性肝炎[10-11]㊂另有研究表明，对于少数急性乙型肝炎患者，经相应后肝功能正常或基本正常,H B V D N A或H B s A g滴度降低，或者行肝组织病理检查发现病变时，还应积极进行干扰素或胸腺肽，以清除病毒，加快乙型肝炎标志物的血清学转换[12-13]㊂本研究中,A H B患者6周后
H B V D N A转阴率为82.5%,H B s A g清除率为
72.5%,H B e A g血清学转换率为75.0%，均取得了较好的疗效㊂
在慢性H B V感染患者，免疫控制对病毒的清除至关重要，但H B V也进化出了相应的机制去逃避免疫系统的清除㊂H B V虽然激活了人体的免疫系统，但可以逃避甚至破坏人体免疫系统，具体机制尚不十分明确㊂受多种因素影响，不同H B V感染者的临床结局往往不同[14-15]㊂在众多参与抗H B V免疫反应细胞里,p D C s发挥着中枢性的作用㊂p D C s可以通过T L R s(T o l l l i k er e c e p t o r s)直接识别H B V的核酸㊁单链R N A以及未甲基化的D N A㊂T L R s(T L R7和T L R9)一经触发,p D C s不但能快速㊁大量的产生I F N-Ⅰ，而且可以产生其他的细胞因子如T N F-α(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r)㊁I L-6(i n t
e r l e u k i n)以及细胞表面共刺激分子[16-17]㊂这些细胞因子即可以直接抑制H B V的复制，而且还可以激活自然杀伤(N K)细胞及T细胞，激活和调控抗病毒免疫，间接发挥清除H B V的作用㊂另外,p D C s还可以直接从被感染的细胞中识别和提成H B V抗原[18-19]㊂
国内外多项基础研究对D C在乙型肝炎动物模型中的作用及可能机制进行了分析探讨，但目前临床应用还较少，这是由于此类方法尚不能达到预期的清除病毒疗效，还有学者研究发现,I L-18具有刺激T h l细胞分泌产生I F N-1及I L-2的功能，进而提高患者细胞免疫功能，因此可能具有增强D C乙型肝炎疗效的作用，但目前仅为临床前期研究[20-21]，进一步相关机制及具体疗效尚需后期开展大规模临床试验来验证㊂
在慢性H B V感染患者，外周血p D C s数量没有变化，似乎不受H B V影响，但发现其功能包括分泌I F N-α的能力受损[22]㊂但也有研究发现,H B V携带者m D C和p D C s的频数和功能无论在体内还是体外均未改变㊂大多数学者认为,H B V不直接影响p D C s㊂我们的研究发现，与健康对照相比，在急性乙型肝炎患者p D C s的频数降低，且在后第6周无明显变化㊂产生这种现象的原因可能为p D C s在慢性H B V感染患者被抑制，并没有发挥相应的作用，数量未出现明显改变㊂而在急性乙型肝炎患者外周血p D C s发挥重要作用，大量p D C s被招募到肝脏参与炎症反应，出现归巢现象[23]，导致外周血p D C s下降，且在后一定时间内仍在肝脏聚集㊂p D C s表面的共刺激分子C D86与T细胞表面的C D28结合后可协同刺激T细胞活化，有助于H B V的清除[24]㊂相对于非活动H B s A g携带者，慢性H B V感染免
疫耐受期患者p D C s表面C D86+表达显著下调[25]，间接说明H B V感染的慢性化的原因可能为p D C s功能受损导致㊂D C的免疫功能取决于其免疫状态，其表面C D83㊁C D86等免疫分子的表达水平低下或缺失将导致D C免疫功能低下或无免疫作用㊂乙型肝炎病毒及其蛋白可抑制p D C功能，经抗病毒后，虽然D C细胞绝对数(C D86A B C)无显著变化，但具有刺激功能的C D86+p D C频数显著增加，表明p D C功能有所恢复[26]㊂本研究发现急性乙型肝炎患者发病初期p D C s表面C D86+的表达上调，且在后仍持续高水平表达㊂而在过程中C D86+p D C s的数量明显增加，提示C D86+p D C s可能在清除H B V 过程中发挥重要作用㊂
总之,p D C s发挥有效的抗病毒作用是清除H B V 的关键，而急性乙型肝炎与慢性乙型肝炎患者p D C s 功能不同的原因，亦或说是p D C s的功能的不同决定了H B V感染的急性清除或慢性携带，其具体机制仍需进一步探讨㊂
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收稿日期:2020-04-07编辑：张卫国
陈小艺刘惠宁㊃327㊃
‘临床荟萃“2020年8月20日第35卷第8期 C l i n i c a l F o c u s,A u g u s t20,2020,V o l35,N o.8
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