收稿日期:2003212203；修回日期:2004202209
基金项目：上海市科委(0149nm .066)、中国科学院(KJCX 12S W 208)和中国科学院上海应用物理研究所(55200321)资金资助项目作者简介：曹金全(1971～)，男(汉族)，福建宁化人，博士，从事纳米材料和放射物研究
第17卷第2期
2004年5月
同 位 素
Jou rnal of Iso topes
V o l .17 N o .2M ay 2004
曹金全，汪勇先，于俊峰，李世强，夏姣云，张春富，尹端氵止
(中国科学院上海应用物理研究所，上海 201800)
摘要：将组氨酸固载到氨基化磁性纳米微粒表面。以188R e 的面式结构三羰基配合物f ac 2[188R e (CO )3
(H 2O )3]+为放射性标记前体，对磁性纳米微粒进行了标记。固载有组氨酸的磁性纳米微粒在70℃、pH 6.6下反应40m in ，标记率为(91.4±0.3)%，并且标记物在37℃的小牛血清中有良好的体外稳定性,72h 后放射性仍保留80%以上。
关键词：磁性纳米微粒；组氨酸;
188
R e ；三羰基配合物f ac 2[188R e (CO )3(H 2O )3]+
；放射性标记
中图分类号:R 817 文献标识码:A 文章编号:100027512(2004)022*******
放射物是近年来发展起来的一种肿瘤方法，这种方法是将放射性核素标记的肿瘤特异物输送到肿瘤位置，利用放射性核
素发出的粒子(Α或Β-粒子、俄歇电子以及内转
化电子)杀死或杀伤肿瘤细胞。188
R e 是一种优良的核素[1,2]，可非常方便地由188W 2188R e 发生器淋洗获得，因此被作为放射物的组分而得到了广泛的应用。
自从1993年Sal m ain 等[3]提出R e 、T c 的金属羰基化合物在核医学方面应用以来,f ac 2[M
(CO )3(H 2O )3]+(M =99T c m ,186 188
R e )用于生物分子的标记已经得到了广泛的研究。f ac 2[M (CO )3(H 2O )3]+有许多优点，比如水溶性较好，在空气及水溶液(pH 2～12)中稳定性好[4]。另外其配位体H 2O 分子很容易被单齿、多齿双功能配体(含N 2N 2N ,N 2N 2O ,N 2N 2S ,P 2P ,P 2P 2O 和S 2S 等键)取代，形成羰基螯合物。因此f ac 2[M (CO )3(H 2O )3]+很可能是一种利用N 杂环化合物标记诸如多肽或者蛋白等生物分子的理想双功能螯合剂[4～7]。三羰基配体为小分子，键合牢固，尤其不容易发生水中主要的竞争反应——质子化反应。另外，由于CO 配体诱导的强d 轨道能级劈裂和d 6电子构型，配合物极具动力学惰性，即使在强竞争介质中也不发生配体交换，这是其生物学应用之基础[8]。这种M (I )的+1价氧化态的动力学惰性可能为99T c m 和可用于放射性
的发射Β-的186 188
R e 的未来应用开辟一条新途径[9]。
采用磁性微球作癌症药物靶向输运的载体，可以快速将药物定向引导至病灶，降低药物的全身分布量，从而减少由此产生的毒副作用；由于药物高度浓聚于病灶，因此还可以提高疗效，降低使用剂量[10～17]。
由于肿瘤组织蛋白质合成速度加快，氨基酸的摄取速度也有所提高，因此放射性核素标记氨基酸可用于肿瘤显像或。L 2组氨酸(L 2H is 2tidine )是人体必需的氨基酸之一，它含有的咪唑基可以和f ac 2[188R e (CO )3(H 2O )3]+发生配体交换反应，形成稳定的配合物。如果用化学键方式将配基(如组氨酸等)固载到磁性纳米微粒表面，就有可能更好地保证磁性纳米微粒固定的放射性核素在生理条件下稳定存在。
188
R e 是优良的用核素，磁性纳米微粒是新兴发展中的药物靶向载体[10,18～21]，因此研制188R e 标记的磁性纳米微粒具有积极意义。本工作拟研究磁性纳米微粒表面组氨酸的固载，以
及利用f ac2[188R e(CO)3(H2O)3]+为前体试剂将188R e标记到固载有组氨酸的磁性纳米微粒表面。
1 实验部分
111 主要试剂和仪器
硅烷偶联剂N2Β2(氨乙基)2Χ2氨丙基三甲氧基硅烷(SG2Si900)：工业品，纯度≥95%，购自南京曙光化工总厂;22N2吗啉乙烷磺酸(M ES)、BH3・N H3为F luka公司产品;L2组氨酸、戊二醛为生化试剂，钠为化学纯，均购自上海化学试剂公司；小牛血清购自卫生部上海生物制品研究所;N d2Fe2B永磁体购自上海跃龙有金属有限公司;CO气体纯度为99.99%，购自上海瑞芳气体公司;188W2188R e发生器：上海科兴药业公司产品;188W由美国橡树岭国家实验室(O RNL)提供；氨基化磁性纳米微粒：自制[2]，由SG2Si900修饰硅胶包覆的磁铁矿纳米微粒[22] (粒径～20nm，饱和磁化率ΡS=60.9em u g，矫顽力H C=23O e)而得，表面伯氨基密度～0.5 mm o l g。
H itach i600型透射电镜(T ran s m issi on E lectron M icro scop e,T E M):H itach i;L EO 1530V P型扫描电镜(Scann ing electron m icro2 scop e,SE M):L EO E lectron M icro scop y L td;
D m ax2550V型X2射线粉末衍射仪:R igaku;
I R IS A dvan tage1000型I CP2A ES:T herm o Jar2 rell A sh(TJA);V ari o EL有机元素分析仪:E l2 em en tar;155型振动样品磁强计(V ib rati on Sam p le M agnetom eter,V S M):EG&G P rince2 ton R esearch;M icro lab M K 型X2射线光电子能谱仪(XPS):V G;A R2000型薄层谱(T h in L ayer Ch rom atograp hy,TL C)仪:B i o scan;SN2 697型Χ计数器：上海日环一厂产品;FJ2391A2型活度计：北京核
仪器厂产品。
112 磁性纳米微粒表面固载组氨酸
以自制的氨基化磁性纳米微粒为原料，戊二醛为交联剂，在氨基化磁性纳米微粒表面固载组氨酸。其固化过程示于图1。1mL氨基化磁性纳米微粒(分散于甲醇中，固体含量>20g L)离心分离后用0.1m o l L pH7.4磷酸盐缓冲溶液(PB S)洗涤，然后分散在1mL含2.5%戊二醛的上述PB S中，快速混匀后4℃孵育4h以上，再离心分离，用上述PB S洗涤，尽量除去过量的游离戊二醛。洗涤好的磁性纳米微粒重新分散于新鲜制备的1mL0.2m o l L L2组氨酸(用pH 7.2的0.1m o l L PB S20.15m o l L N aC l20.005 m o l L ED TA缓冲溶液配制)溶液中，室温孵育12h以上，离心分离，用pH9.2的0.1m o l L 硼酸盐缓冲溶液洗涤，然后用含0.5g L N aBH4的0.1m o l L硼酸盐缓冲溶液封闭过量的醛基和不饱和双键(4℃,30m in)。再离心，用PB S洗涤，最后分散于1mL pH～6.6的0.5m o l L22 N2吗啉乙烷磺酸(M ES)缓冲溶液中，用于188R e 标记。
113 标记
1.3.1 f ac2[188R e(CO)3(H2O)3]+的制备 参照Sch ib li等[9]介绍的方法。称取5m g BH3・N H3，放入一个10mL的洁净干燥西林瓶中，加橡皮帽和铝盖，密封，通CO气体约20m in。在1 mL无载体188R eO4-生理盐水淋洗液中加入6ΛL85%H3PO4，混匀后注射到西林瓶中,70～80℃水浴加热约15m
in。期间，用一支10mL 的注射器平衡反应产生的氢气。反应结束后，西林瓶用碎冰冷却。用薄层谱法(TL C)测定反应产率,S I L G F254玻基硅胶薄板为固定相，以V(甲醇)∶V(36%盐酸)=99∶1为流动相展开。188R e2胶体的R f=0,f ac2[188R e(CO)3 (H2O)3]+的R f=0.4～0.6，而游离188R eO4-的R f=0.8～110。
1.3.2 f ac2[188R e(CO)3(H2O)3]+与固定化组氨酸的结合 吸取100ΛL经Sep2Pak柱分离纯化，去除188R e胶体和游离188R eO4-的f ac2[188R e (CO)3(H2O)3]+溶液，加到1.5mL微型离心管中，与100ΛL固载了组氨酸的磁性纳米微粒(M N2H is，分散于pH～6.6的0.5m o l L M ES 缓冲溶液中，固体含量>20g L)相混合,60～80℃反应30～50m in。离心或磁场分离，总放射性及上清液的放射性用Χ计数器或活度计测定，标记率根据公式(1)计算。
向氏兄弟Γ=(1-上清液的放射性 总放射性)
×100%(1) 1.3.3 体外稳定性 将标记好的磁性纳米微粒用蒸馏水或者生理盐水洗涤2遍，然后分散于1 mL小牛血清中,37℃振荡孵育，于1、4、24、48、72h取样，并测定其放射性计数。放射性保留率仿照公式(1)计算。
58
第2期 曹金全等：磁性纳米微粒的188R e标记
图1 组氨酸的固定化过程
2 结果与讨论
211 组氨酸的固定
虚拟货币正规交易平台对M N2H is和L2组氨酸原料进行了XPS 分析。样品处理：将L2组氨酸和M N2H is固体研磨成极细小的粉末。然后将粉末分散在导电双面胶带的一面上。胶带的另一面粘附在样品架头上。测定两者的N1s电子结合能，结果示于图2。分析图2可知,L2组氨酸的的三个N原子(Α2氨基及咪唑基上的N原子)在M N2H is的XPS中有所体现，尽管位置稍微不同，但以C1s为标准，进行校正，结合能位置实际上是一致的。因此可以认定后者表面固载了组氨酸。
212 标记
用TL C分析f ac2[188R e(CO)3(H2O)3]+的产率是(85.7±6.1)%，经Sep2Pak柱纯化后放化纯度高于95%。而在优化的条件(pH6.6,70℃下反应40m in)下,M N2H is的188R e标记率为(91.4±0.3)%。反应温度、时间、缓冲溶液的pH 等对磁性纳米微粒的标记率都有影响。
2.2.1 反应温度对标记率的影响 固定反应时间(45m in)和缓冲溶液pH(6.6)，改变反应温度，观察反应温度对标记率的影响，结果示于图3。由图3可知，当反应温度升至60～90℃时，有较高的标记率，
因此选取70℃为最佳反应温度。
2.2.2 反应时间对标记率的影响 固定反应温度(70℃)和缓冲溶液pH(6.6)，改变反应时间，观察标记率的变化，结果示于图4。由图4可知，当反应时间>30m in时，有较好的标记率，一般选取反应时间为40m in。
2.2.3 反应体系pH对标记率的影响 固定反应温度(60℃)和反应时间(40m in)，改变缓冲溶液pH，观察标记率的变化，结果示于图5。由图5可知，在pH=6.2～6.7范围内，有较好的标记率,pH=6.6时标记率最高,pH继续升高时，标记率很快下降。因此，实验中选用pH为6.6。
213 无固载组氨酸的氨基化磁性纳米微粒的188Re标记
在2.2优化后的条件下，对没有固载组氨酸的氨基化磁性纳米微粒进行了标记，结果显示标记率很低，仅为21%。由于制备f ac2[188R e(CO)3 (H2O)3]+时生成的188R e胶体量很少，且标记前经纯化，因此可以排除188R e胶体在磁性纳米微粒表面的吸附。SG2Si900修饰的磁性纳米微粒
68同 位 素 第17卷
表面含有伯氨基和仲氨基，类似乙二胺结构，推测能与f ac 2[188R e (CO )3(H 2O )3
]+反应形成了较不稳定的螯合物，这是能够进行标记的化学基础。这也印证了f ac 2[188R e (CO )3(H 2O )3]+的配位化学性质——不与脂肪胺和硫醚形成稳定的配合物，而倾向于与芳香胺的“软”的sp 2构型的
N 原子配位。
214 标记物的稳定性
结果示于图6。由图6可知，标记物在小牛血清中3天后仍有80%以上的放射性保留在磁性纳米微粒上
。
图2 L -组氨酸(A )和M N -H is (B )的N 1s
结合能谱峰解析
图3 反应温度对M N -H is
标记率的影响
图4 反应时间对M N -H is
的标记率的影响图5 缓冲溶液pH 对M N -H is 标记率的影响
明星陪客价格表图6 188Re 标记M N -H is 在小牛血清中的稳定性
7
8 第2期 曹金全等：磁性纳米微粒的188R e 标记
3 小 结
在氨基化磁性纳米微粒表面固载了组氨酸。合成了f ac2[188R e(CO)3(H2O)3]+标记前体，标记到M N2H is上；在优化的条件下，有较高的标记率和较好的体外稳定性。这为发展肝癌的新型放射盒提供了基础。
参考文献:
[1] Y in D Z,H u W Q,Cai X M,et al.A Study on
P reparati on of188W2188R e Generato r[J].N ucl
T ech,1998,21(1):51～55.
[2] Knapp FFJ,Beets AL,Guh lke S.A vailab ility of
R hen ium2188F rom the A lum ina2based T ungsten2
188 R hen ium2188Generato r fo r P reparati on of
R hen ium21882labeled R adi opharm aceu ticals fo r
Cancer T reatm en t[J].A n ticancer R es,1997,17:
1783～1796.
[3] Sal m ain M,Gunn M,Go rftiA,et al.L abeling of
P ro tein s by O rganom etallic Comp lexes of R hen i2
2011韩剧排行榜um(1).Syn thesis and B i o logical A ctivity of the
贵州省旅游景点Con jugates[J].B i ocon jugate Chem,1993,1003:
425～433.
[4] A lberto R,Sch ib li R,Egli A,et al.A N ovel
O rganom etallic A qua Comp lex of T echnetium fo r
the L abeling of B i omo lecu les:Syn thesis of[99m T c
(OH2)3(CO)3]+F rom99m T c O4-in A queou s So lu2
ti on and Its R eacti on W ith a B ifuncti onal L igand
[J].J Am Chem Soc,1998,120:7987～7988.
[5] A lberto R,Sch ib li R,W aibel R,et al.Basic
A queou s Chem istry of[M(OH2)3(CO)3]+(M=
R e,T c)D irected Tow ards R adi opharm aceu tical
A pp licati on[J].Coo rdinati on Chem R ev,1999,
190～192:901～919.
[6] Egli A,A lberto R,T annah ill L,et al.O rgano2
m etallic T c299m2aquai on L abels Pep tide to an U n2
p receden ted H igh Specific A ctivity[J].J N ucl
M ed,1999,40:1913～1917.
[7] M etzler2N o lte N.L abeling of B i omo lecu les fo r
M edicinal A pp licati on s2B i oo rganom etallic Chem2
istry at Its Best[J].A ngew Chem In t Ed,2001,
40:1040～1043.
[8] A lberto R,Sch ib li R,Schub iger A P.F irst A pp li2
cati on of f ac2[99m T c(OH2)3(CO)3]+in
B i oo rganom etallic Chem istry:D esign,Structu re,
and in V itro A ffin ity of A52H T1A R ecep to r L ig2 and L abeled W ith99m T c[J].J Am Chem Soc,
1999,121:6076～6077.
xl是多大尺码[9] Sch ib li R,Schw arzbach R,A lberto R,et al.
Step s Tow ard H igh Specific A ctivity L abeling of
B i omo lecu les fo r T herapeu tic A pp licati on:P repa2
rati on of P recu rso r[188R e(OH2)3(CO)3]+and
Syn thesis of T ailo r2m ade B ifuncti onal L igand Sys2
tem s[J].B i ocon jugate Chem,2002,13(4):750～756.
[10] W idder KJ,Senyei A E,Scarpelli D G.M agnetic
M icro spheres:a M odel System fo r Site Specific
D rug D elivery in V ivo[J].P roc Soc Exp B i o
M ed,1978,58:141～146.
[11] H a¨feli UO,Pauer GJ,M ack lis RM.T reatm en t
of M ou se T umo rs W ith R adi oactive M agnetic
M icro spheres:M odel fo r In tracavitary R adi o2
therapy[J].P roceedings of the In ternati onal
Sympo sium on Con tro lled R elease of B i oactive
M aterials,1995,22:89～90.
[12] H a¨feli UO,Sw eeney S M,Beresfo rd BA,et al.
Effective T argeting of M agnetic R adi oactive90Y2
m icro spheres to T umo r Cells by an Ex ternally
A pp lied M agnetic F ield.P reli m inary in V itro
and in V ivo R esu lts[J].N ucl M ed B i o l,1995,
22(2):147～155.
[13] H a¨feli UO,Pauer GJ,RobertsW K,et al.
M agnetically T argeted M icro spheres fo r In tra2
cavitary and In trasp inal Y290R adi o therapy[A].
In ternati onal Conf on Scien tific and C lin ical A p2
p licati on s of M agnetic Carriers[C].N ew Yo rk:
P lenum P ress.1997.
[14] H a¨feli UO,Pauer GJ,Failing S,et al.R adi o la2
beling of M agnetic Particles W ith R hen ium2188
fo r Cancer T herapy[J].J M agn M agn M at,
2001,225:73～78.
[15] H a¨feli UO.R adi o labeled and M agnetic Particu2
88同 位 素 第17卷
发布评论