㊃论著㊃
通信作者：刘立坤,E m a i l :l l k l i u l i k u n @163.c o m
1例罕见B (A )
(河北医科大学第三医院输血科，河北石家庄050051
) 摘 要：目的 鉴定罕见B (A )血型并探讨其临床安全输血策略㊂方法 利用全自动血型分析仪检测A B O 血
型，发现正反定型不符的一位患者，利用血型血清学和分子生物学方法对该患者及其家系中9位成员进行血型鉴定和
A B O 血型基因测序,
分析该家族血型的遗传特点；并对该血型的患者进行临床输血探讨，确保临床输血安全㊂结果 患者为B (A )血型，与B 101基因序列比对，均为n t 640A>G ，基因型鉴定为B (A )04/O 01,B (A )型血清与同型红细胞以及O 型㊁B 型红细胞不凝集,B (A )型红细胞与同型以及A B 型血清不凝集㊂结论 血型血清学方法可以对正反定型不符的B (A )血型做出初步判断，分子生物学技术可以进一步准确判断该血型；临床输血应采取自体输血㊁同型输注及配合相容性输血㊂
关键词:A B O 血型系统;B (A )亚型；血清学；家系调查;A B O 基因分型;D N A 测序；安全输血中图分类号:R 392.11 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2018)06-0510-05
d o i :10.3969/j
.i s s n .1004-583X.2018.06.013S t u d y o n t h e i d e n t i f i c a t i o no f a c a s ew i t hb l o o d t y p
eB (A )a n d t h e c o n c e r n e d c l i n i c a l s a f e t y t r a n s f u s i o n s t r a t e g
i e s L i uL i k u n ,L i a n g J u y o u ,C h e n J i n g ,Y a oY a o ,G u o M e n g
,L iX i a o n a ,Z h a o J u n l i ,Z h a oY i r a n ,X i n g Q i a o l i n g ,P a nH o n g j u a n ,L iX u t o n g
D e p a r t m e n t o f B l o o dT r a n s f u s i o n ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,
S h i j i a z h u a n g 0
50051,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a
u t h o r :L i uL i k u n ,E m a i l :l l k l i u l i k u n @163.c o m A B S T R A C T :O b j
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f y t h eb l o o dt y p eB (A )w h i c h i sr a r e t os e e ,a n dt o i n v e s t i
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i n i c a l b l o o d t r a n s f u s i o n s a f e t y s t r a t e g i e s .M e t h o d s A u t o m a t i cb l o o da n a l y z e rw a su s e d t od e t e c tA B Ob l o o d g r o u p ,a n d t h e g r o u p t y p i n g a n dr e v e r s et y p i n g o fa p a t i e n tw e r ef o u n dt ob e i n c o n s i s t e n t .T h e nt h eb l o o dt y p
ea n d g e n e s e q u e n c i n g o ft h i s p a t i e n ta n dn i n eo ft h ef a m i l y m e m b e r s w e r ei d e n t i f i e db y b l o o d g r o u p s e r o l o g y a n d m o l e c u l a r b i o l o g y t oa n a l y z et h e g e n e t i cc h a r a c t e r i s t i co ft h eb l o o d g r o u p o ft h i sf a m i l y a n dc l i n i c a l t r a n s f u s i o nr e s e a r c h w a s c o n d u c t e do n t h e mt oe n s u r e t h es a f e t y o
f c l i n i c a lb l o o dt r a n s f u s i o n .R e s u l t s W h i c h w a s c o n t r a s t e d w i t hB 101
g e n e s e q u e n c ew e r e a l l n t 640A>Ga n dB (A )04/O 01b yg e n e i d e n t i f i c a t i o n .T
h e r ew a sn oa g g l u t
i n a t i o nb e t w e e ns e r u m B (A )a n dO ,B ,B (A )r e db l o o dc e l l s .B (A )r e db l o o dc e l l sd on o ta g g l u t i n a t e w i t ht y p
eB (A )a n d A Bs e r u m.C o n c l u s i o n T h e g r o u p t y p i n g a n dr e v e r s et y p i n g w e r e i d e n t i f i e da sB (A )w i t hb l o o d g r o u p s e r o l o g y t h a tc o u l db e f u r t h e rc o n f i r m e d b y m o l e c u l a r b i o l o g i c a lt e c h n i q u e s ;c l i n i c a l b l o o d t r a n s f u s i o n s h o u l d a d o p t a u t o l o g
o u s b l o o d t r a n s f u s i o n ,s a m e -t y p e i n f u s i o na n d c o m p a t i b l eb l o o d t r a n s f u s i o n .K E Y W O R D S :A B O b l o o d -g r o u p s y s t e m ;B (A )b l o o dt y p e ;s e r o l o g y ;F a m i l y i n v e s t i g a t i o n ;A B O g e n o t y p i n g ;D N As e q u e n c i n g ;s a f e t y t
r a n s f u s i o n A B O 血型系统是临床输血工作中最主要的血型系统，而B (A )型是一种罕见的A B O 血型系统的亚
型，在我国北方人中的发生频率仅为1/(5~10)
万[1]
㊂此血型最早在1985年被Y a m a m o t o 等[2]发现，国内采用分子生物学技术诊断此血型最早见于
2004年[3]
,
特点是血清学表现为正反定型不符，容易造成血型鉴定中的误判，给临床输血带来极大的安
全隐患㊂我院输血科发现一位患者血型正反定型不
符，经血清学及分子生物学鉴定判断为B (A )血型，并对该血型的临床安全输血策略进行了初步探讨，现报告如下㊂1 资料与方法
1.1 标本来源 患者即家系先证者，女,60岁，汉族，股骨颈骨折，无其他疾病和疾病史，无输血史，有孕产史，无家族遗传病史，术前抽取E D T A 抗凝全血进行血型鉴定㊂经医院伦理委员会批准，先证者及其家庭成员同意，对先证者家系中的3代10名成员进行
E D T A 抗凝全血血型鉴定及家系血型调查分析㊂㊃
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1.2试剂与仪器试剂：血型检测卡(批号20170815)㊁抗人球蛋白卡(批号20170802)均由长春博迅生物技术有限责任公司生
产；单克隆抗-A及抗-B血型定型试剂(批号均为20170510)及标准A1细胞㊁B细胞㊁O细胞(批号均为20175336)㊁抗-H(批号201710918)㊁抗-A1(批号20171031)㊁抗体筛查细胞(Ⅰc㊁Ⅱc㊁Ⅲc)(批号均为20177042)等均由上海血液生物医药有限责任公司生产;A2细胞(L O T 112821㊁I mm u c o r)；自身红细胞(本科室自制),D N A 提取试剂盒(T I A N a m p B l o o dD N A K i t，北京天根生化科技有限公司)㊂仪器：全自动血型分析仪(M i c r o l a b S T A R l e t I V D/185015)，血型专用离心机(台湾贝索)，电泳仪(B a y G e n eB G-P o w e r300), P C R扩增仪(B i o-R a dC1000T h e r m a i C y c l e r),3730基因测序仪(美国A B I公司)㊂
1.3方法
1.3.1血型鉴定采用微柱凝胶法和试管法进行血型鉴定，试管法分别在4ħ㊁室温㊁37ħ进行血清学血型鉴定；血型亚型鉴定：利用抗-A1试剂与受检红细胞反应判断红细胞上A抗原类型，利用抗-H试剂和受检红细胞的凝集强度判断待检红细胞上H抗原活性；利用标准A2红细胞与受检血清反应判断待检血清中不规侧抗-A抗体类型；应用抗人球蛋白法进行患者血清的抗体筛查㊁直接抗球蛋白㊁间接抗球蛋白实验㊂以上实验均严格按说明书操作㊂通过家系调查了解亚型基因的传递情况㊂
1.3.2 D N A提取采集受检者E D T A抗凝全血5 m l，用D N A提取试剂盒快速提取D N A，严格按照说明书进行操作㊂用D N A分析仪将D N A终浓度调整为30~40n g/μl，纯度为1.60~1.80㊂
1.3.3 P C R扩增测序 A B O第6㊁第7外显子进行P C R扩增测序，参照O l s s o n等[4]的方法，引物设计如下:6F5ᶄ-C G
G G A T C C A G G G T G G C A C C C T G C C-3ᶄ, 6R5ᶄ-C G G A A T T C A C T C G C C A C T G C C T G G G T C T C-3ᶄ; 7F5ᶄ-C G G G A T C C C C G T C C G C C T G C C T T G C A G-3ᶄ, 7R5ᶄ-G G G C C T A G G C T T C A G T T A C T C-3ᶄ㊂以提取的D N A为模板，反应总体积25μl，包括T a q D N A聚合酶(10mm o l/L)0.2μl,10ˑ缓冲液
2.5μl,d N T P (10mm o l/L)2μl，上㊁下游引物(10μm o l/L)各1μl,D N A模板1μl和H2O17.3μl㊂扩增条件:95ħ5分钟，然后95ħ变性30秒,62ħ退火30秒,72ħ延伸45秒,35个循环后,72ħ5分钟㊂取55μl P C R扩增产物,D N A M a r k3μl经过2.0%琼脂糖凝胶(80V)电泳30分钟，确定扩增片段的特异性，扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，正㊁反向测通，测序引物与扩增引物相同，利用c h r o m a s软件，与B101序列使用D N A S T A R软件的C l u s t a l进行序列比对，分析结果㊂
1.3.4 B(A)型血液与其他型血液交叉配血分别在盐水介质㊁凝聚胺介质及抗人球蛋白介质中进行
交叉配血实验，当B(A)型的个体作为受血者和献血者时其血清和红细胞分别与A㊁B㊁O㊁A B4种血型个体的红细胞和血清进行主㊁次侧配血，分析探讨其相
容情况㊂
2结果
2.1 A B O血型鉴定微柱凝胶法与试管法均显示患者红细胞上B抗原活性较强(4+),A抗原活性较弱(2+)；血清中存在不规侧抗-A抗体(3+)，正反定型不符，怀疑A B O血型系统的A B亚型，见表1㊂
表1患者A B O血型鉴定结果
反应条件
正定型
抗-A抗-B
反定型
A1c B c O c自身对照微柱法2+4+3+0/0 4ħ3+w4+4+ʃʃʃ
试管法室温2+4+3+000 37ħ2+4+3+000
2.2抗体筛查㊁直接抗球蛋白㊁间接抗球蛋白实验抗体筛查实验结果为阴性，排除A B O血型系统以外的不规侧抗体；直接抗球蛋白实验阴性，排除红细胞上黏附的自身抗体对血型正定型的干扰；间接抗球蛋白实验阴性，排除血清中存在干扰血型反定型的因素，见表2㊂
表2抗体筛查㊁直接抗球蛋白㊁间接抗球蛋白实验结果
反应条件P s+Ⅰc P s+Ⅱc P s+Ⅲc P c 盐水法000/凝聚胺法0000抗球蛋白法0000
注:P s为患者血清,P c为患者红细胞
2.3血型亚型鉴定试验
2.3.1患者红细胞与抗-A1反应分别以标准A2㊁A1红细胞与抗-A1试剂反应做阴㊁阳性对照㊂患者红细胞与抗-A1不凝集，标准A1红细胞与抗-A1试剂强凝集呈4+，标准A2红细胞与抗-A1试剂不凝集，实验结果可信，怀疑该患者血型可能为A B亚型或B(A)型㊂
2.3.2患者红细胞与抗-H试剂反应分别以标准O型红细胞㊁B型红细胞㊁A B型红细胞与抗-H反应做对照㊂患者红细胞与抗-H凝集增强呈4+,O型红细胞与抗-H强凝集呈4+,B型红细胞与抗-H凝集呈2+,A B型红细胞与抗-H极弱凝集呈ʃ，对照
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实验反应格局明确，表明实验结果可信，此结果不符
合A B 亚型的反应格局，而比较符合B (A )型的反应格局，排除A B 亚型，高度怀疑患者血型为B (A )
型㊂2.3.3 患者血清与标准A 2红细胞反应 分别以抗-A 1㊁抗-A 试剂与A 2红细胞反应做为阴㊁阳性对照，患者血清与标准A 1红细胞凝集3+㊁与A 2红细
胞凝集2+，抗-A 1试剂与A 2红细胞不凝集，抗-A
试剂与A 2红细胞凝集强度呈3+，说明实验结果可信，再次排除A B 亚型，初步判断为B (A )
型㊂2.4 患者家系调查 在患者3代10名家系成员中,
有5人的血清学结果符合B (A )型，见表3；显示患者血型抗原具有家系遗传特点，家系血型遗传情况如图1㊂
表3 患者家系血型血清学反应
家系成员正定型
抗-A 抗-B
抗-A 1抗-H 反定型
A 1c
B c O c A 2c
碱基取代血型诊断Ⅰ12+
4+03+s 3+s 002+A 640G B (A )04/O 01Ⅰ22+w 4+03+s
3+s 002+w
A 640G
B (A )04/O 01Ⅰ304+02+w 4+003+/B /O 01Ⅰ404+0
2+w 4+0
03+/B /O 01
Ⅱ14+03+1+w 0
4+00/
A /O 01Ⅱ22+4+04+3+001+A 640G
B (A )04/O 01Ⅱ34+03+ʃ
04+00/A /O 01Ⅱ40
4+01+s 4+003+/
B /O 01Ⅲ11+4+w 04+3+001+A 640G B (A )04/O 01Ⅲ2
2+3+s
04+
3+00
1+s A 640G B (A )04/O 0
1
图1 患者血型家系遗传图 ʏӘ：分别为B (A )04血型的男女;↗：先证者
2.5 A B O 基因直接测序 先证者及其家系成员的
直接测序结果显示第6外显子n t 261d e l G ，由于n t 261位发生了移码突变，因此又进行反向测序；另外第7外显子的碱基序列与B 101标准序列相比出现n t 640A>G ，突变结果符合B (A )04/O 01的特点，导致血型由原来的B 101型改变为B (A )04型，其编码的糖基转移酶在214位由原来的甲硫氨酸变为缬氨酸，从而改变了血型抗原的血清学性质，见图2,3㊂
2.6 B (A )
型血液与其他型血交叉配血 交叉配血结果显示，患者B (A )型血清与同型红细胞以及O 型㊁B 型红细胞不发生凝集反应,B (A )型红细胞与同型以及A B 型血清不凝集,
见表4㊂图2 B 101第7
外显子标准碱基序列
图3 先证者第7外显子碱基序列
表4 B (A )型血液与A ㊁B ㊁O ㊁A B 等不同血型血液交叉配血实验结果配血实验B (A )c
盐水法凝聚胺法抗球蛋白法B (A )s
盐水法凝聚胺法抗球蛋白法
A s 3+3+4+///
B s
w+
+
+
///O s
4+4+4+///A B s
000///B (A )s 0
00/
//
A c ///3+3+4+
B c ///000O c
///000A B c
///3+4+4+
B (A )c
///000 注：标注 s 均为不同血型的血清，标注 c
均为不同血型的红细胞3 讨 论
美国输血技术手册A A B B (14t h 版)对B (A )
表现型这样描述的，某些B 型个体的红细胞可以被某些鼠源性的单克隆抗体所凝集，这种试剂含有鼠单克
隆抗体MH 04㊂有些个体B 型半乳糖基转移酶除了使大量D -半乳糖黏附于红细胞表面前体物质上，也可以使少量N -乙酰半乳糖黏附于血型前体物质上[5]
，因此血清学表现接近正常B 抗原特异性和少量A 抗原特异性，血清中存在针对较弱抗原(A 抗
㊃
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原)的不规则抗-A抗体，出现正反定型不符的血清学反应㊂
本试验中患者红细胞与抗-A1不凝集，患者血清与标准A1红细胞凝集3+㊁与A2红细胞凝集2+，实验结果符合A A B B(14t h版)对B(A)的描述，原因是B(A)红细胞是由B基因单碱基突变表达弱的A 抗原活性，并不是A基因的突变导致的A抗原减弱或活性降低㊂虽然某些A B亚型的血清学反应格局与B(A)亚型相似，但A B亚型产生的抗体是抗-A1抗体，不与A2红细胞发生凝集反应[6]㊂实验中患者红细胞与抗-H凝集增强呈4+，这与文献[7]对B(A)红细胞上H抗原含量活性与O红细胞相当或稍弱，强于B101细胞一致，其与抗-H的凝集反应会增强，一般为3+~4+[8]㊂本试验中先证者及其4位家系成员的血清学反应结果均出现了较典型的血清学实验结果，可以初步判断先证者血型为B(A)型㊂在实际工作中，当血清学方法难以判断解释血型结果时，应进一步使用基因分型技术排除造成正反不符的干扰因素，以便得出准确的血型结果㊂A B O等位基因共包括7个外显子和6个内含子,91%的糖基转移酶催化序列位于第6㊁7外显子两个区域[9]，当这两个区域发生单个或多个碱基突变时，会导致红细胞上A或B抗原的活性和数量改变，表现为正反定型不符的A B O亚型㊂目前，国际上报道有6种等位基因的B(A)血型，即B(A)01㊁B(A)02㊁B(A)03㊁B (A)04㊁B(A)05㊁(A)06等，在我国以B(A)02 (n t700C>G)㊁B(A)04(n t640A>G)较常见[10-11]㊂本实验中患者及其他4位家系成员的B基因均发生了n t640A>G单碱基错义突变，符合B(A)04，导致编码的B型糖基转移酶第214位的甲硫氨酸变为缬氨酸，从而改变了酶活性中心"结合凹槽"的大小和形态，
可以容纳N-乙酰氨基半乳糖(G a l N a a c)，最终使B型糖基转移酶可以部分转移N-乙酰氨基半乳糖(G a l N a a c)，具有了双功能活性[12-13]㊂另有说法认为214位甲硫氨酸变为缬氨酸，可能影响酶的转运效率，进而影响糖基转移酶的活性[14]，具体原因还有待于进一步研究㊂
理论上B(A)血型个体绝大多数基因型应该是B (A)/O的杂合子，具有家系遗传特性，而某些疾病导致的抗原减弱无此特性，因此采用家系调查，了解弱抗原的传递情况，对弱抗原的性质判断，具有一定的辅助功能㊂本实验中先证者及其4位家系成员的直接测序结果均为n t640A>G符合B(A)04，有着明显的家系遗传特性，辅助证明了先证者的血清学鉴定结果，家系调查的应用价值在一些不具备分子生物学检测能力的医疗机构更为突显㊂
目前，对于B(A)型的受血者还没有统一的输血标准㊂鉴于B(A)型的特殊性，我们在血型鉴定中非常容易将其误定为A B型或B型，无论哪种结果，在临床输血时，都有可能产生严重后果㊂本试验分别用A型㊁B型㊁O型㊁A B型以及B(A)型作为供血者，我们发现一旦将B(A)型误定为A B型时，其接受A B 型供血者的红细胞后其血浆中的抗-A抗体即可与A B型供血者红细胞上的A抗原发生凝集反应，输注后即出现急性溶血性输血反应，甚至危及生命；如果将其误定为B型，在大量接受了B型供血者血浆中的抗-A抗体可以与B(A)型受血者红细胞上的A抗原凝集，同样会出现输血反应㊂B(A)型的个体作为供血者，我们又分别与A型㊁B型㊁O型㊁A B型以及B(A)型的受血者进行了交叉配血，我们发现其误判血型同样是非常危险的事情，如果将B(A)型误定为A B型,A B型受血者大量接受其血浆输注时,B(A)型供血者血浆中的抗体会与A B型受血者红细胞出现凝集，引起输血反应；如果将其误定为B型,B型受血者血浆中的抗-A抗体可以与B(A)型供血者红细胞上的A抗原凝集，同样也会引起急性溶血性输血反应㊂因此B(A)型的血型鉴定一定要引起高度的重视，当我们对B(A)型个体有了正
确的血型判断后,B(A)型的受血者，应当尽可能进行同型或自体血液输注，在患者情况紧急无库存同型血时，按照我们的试验结果，我们应为患者推荐O型或B型洗涤红细胞以及A B型血浆㊁血小板㊁冷沉淀等血液成分进行输注;B(A)型个体作为供血者时，应首先选择同型的受血者予以输注，当血源非常紧张的情况下，其洗涤后的红细胞可以给予A B型受血者，其血浆应给予B或O的受血者，从而达到安全输血的目的㊂
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收稿日期:2018-01-18编辑:
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张卫国
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收稿日期:2018-01-07编辑：王秋红
㊃415㊃‘临床荟萃“2018年6月5日第33卷第6期 C l i n i c a l F o c u s,J u n e5,2018,V o l33,N o.6
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