口腔护理用品工业ORAL CARE INDUSTRY 第三十一卷第一册2021年2月
6
-研究报告-
云南白药活性肽牙膏成分有效性研究
及牙膏临床验证
张秋霞刘萍宁科功伍鹏蔡英李劲峰李黎仙
陈邈孔祥烨高鹰*
（云南白药集团股份有限公司，云南昆明650217）
摘要：目的：探讨云南白药提取物和美洲大蠊提取物的组合物（BYPA）对抗炎、止血、促进口腔溃疡愈合，及初期牙周炎的有效性。同时利用该组合物制成牙膏（云南
白药活性肽牙膏），对牙膏减轻牙龈问题效果进行临床观察验证。方法：通过研究BY­
PA对ICR小鼠耳壳急性炎症反应；对小鼠断尾出血的止血作用；对豚鼠口腔溃疡的治
疗作用；对家兔口腔溃疡的作用；及对大鼠牙周炎情况来评价BYPA对常见口
腔问题的效果。同时对含BYPA的牙膏产品，按中华人民共和国卫生行业标准WS/T
322.1-2017要求进行临床验证。结果：BYPA对小鼠耳壳炎性肿胀有50.8%的抑制作
用，肿胀度与模型对照组比较有显著统计学差异（P<0.01）；BYPA对清醒小鼠断尾出
血时间有明显缩短（P<0.00）；豚鼠口腔溃疡面积减小明显（P<0.0））；口腔溃疡完全
愈合时间也明显小于溶媒对照组（P<0.0））；家兔口腔溃疡面积均有明显的减小（P<
0.00或P<0.01），口腔溃疡感染程度有非常显著改善（P<0.0）），口腔溃疡完全愈合
时间有明显缩短（P<0.01）；BYPA对牙周炎大鼠，给药0周后，牙周探诊深度（P<
0.01）、龈沟出血指数（P<0.01）、牙龈指数（P<0.05）、牙菌斑指数（P<0.01）均有良
好的改善效果。云南白药活性肽牙膏，通过3个月的连续使用，对牙龈指数（P<
0.01），龈沟出血指数（P<0.01），牙周社区指数（P<0.05）有非常明显的改善。结论：
BYPA有良好消炎、止血、促进溃疡组织愈合作用，对实验大鼠牙周炎的缓解和是
有效的。云南白药活性肽牙膏对牙龈炎有很好的减轻和改善作用；对牙周不健康问题
有相应的改善和修复作用。
关键词：云南白药提取物；美洲大蠊提取物；抗炎；止血；口腔溃疡；牙周炎；云南白药活性肽牙膏
中图分类号:TS文献标识码:A文章编号：2090-3367（2221）01-06-08
引言
云南白药散剂创始于1702年，主要功能为化瘀止血，活血止痛，解毒消肿。用于跌打损伤，瘀血肿痛，吐血，咳血，便血，疮疡肿毒及软组织挫伤，溃疡病出血，以及皮扶感染性疾病。迄今为止在众多的临床研究中显示，对于多种出血性疾病都有明显的疗效，可以加速止血、缩短病程。其机理主要是缩短出血时间和凝血时间，云南白药能使凝血酶原时间缩短，增加凝血酶原含量⑴，并能诱导血小板的聚集和释放［2］0对于创伤出血、消化道出血、呼吸道出血、出血性脑病，妇科、小儿科、五官科出血性疾病都有很好的效果；同时云南白药通过抑制组胺和PG炎症物质的释放，有效减弱炎性介质所引起的肿胀和毛细血管渗透性；改善微循环，促进组织生长因子增殖⑶，使炎症组织得到良好修复。
美洲大蠊（Periplanetaamericana）提取物主要化学成分为肽类、多种氨基酸、核苷类、信息素类、多元醇、蛋白质、糖类、生物碱类、有机酸以及脂肪酸等化合物［4，］0在临床主要应用于消化科、口腔科、外科、耳鼻喉科等创面修复的中。功能为促进组织修复，调节免疫功能等［6-8］，外用特别对烧伤、烫伤、压疮等修复效果显著。
利用云南白药提取物和美洲大蠊提取物组合成更有效的活性组合物，并用于牙膏产品中使其发挥良好的保护口腔组织、减少口腔问题的作用。
】实验材料
6C主要试药
云南白药活性肽组合物（云南白药美洲大蠊组合物BYPA）由云南白药集团股份有限公司提供。氯化钠，二甲苯，丙酮，甲醛，苯酚，冰醋酸，水合氯醛，乙醇,32%过氧化氢为常规分析纯试剂。依文思蓝：深蓝粉末，规格5y/瓶，批号M3474,MP Bio-medicols,LLC，法国。白砂糖：耿马三山牌白砂糖。亚甲蓝：北京化工厂，批号865522。
62实验动物
ICR小鼠，SPF级,26~32g，雄性，动物合格证号SCXK（川）2213-24，购自成都达硕生物科技有限
公司。
KM小鼠,S PF级,26~32g，雄性，动物合格证号SCXK（川）2213-24，购自成都达硕生物科技有限公司。
SD大鼠,SPF级,202~222g，雄性，动物合格证号SCXK（川）2213-24，购自成都达硕生物科技有限公司。
Hartley豚鼠：健康一级，雄性,202~302g，动物合格证号SCXK（川）2213-14，购自四川省动物管理委员会养殖场。
日本大耳白兔：健康一级，雄性，2.2~3.2kg，动物合格证号SCXK（川）2213-14，购自四川省实验动物专委会养殖场。
1■2动物饲养
动物常规饲养于四川大学华西药学院动物房，实验动物设施使用许可证号:SYXK（川）2213-113号。饲养条件：笼养，小鼠、大鼠、豚鼠5只/笼；家兔2只/笼。自然照明，自由觅食及摄水。室温23±3C；湿度54%~65%。动物饲料购自四川大学实验动物中心。饮水为高压灭菌蒸馏水。
2实验方法与结果
2.2组合物对二甲苯所致ICR小鼠耳壳急性炎症反应的影响
雄性SPF级ICR小鼠，禁食16小时后称重，挑选体重22~32g合格动物，按体重随机分组，随机均分为3组：空白正常组、模型组、受试品组，每组16只。除正常组小鼠右耳给予54只生理盐水外，其余各组小鼠右耳在给予52弘/只二甲苯刺激后，分别于16分钟、32分钟、45分钟耳廓局部给予不同受试品溶液74弘/只，溶媒对照组给予等体积生理盐水,65分钟时颈椎脱臼处死动物，沿耳廓基线剪下两耳，盲法用打孔器（直径4mm）分别在相同部位打下圆耳片、1/万电子天秤称重。以左右两耳片重量之差作为耳肿胀度。
肿胀抑制率=（模型组肿胀度-给药组肿胀度）/模型组肿胀度X102%
实验结果用均数土标准差表示，采用SPSS17.2软件One-Way ANOVA分析进行组间差异的显著性检验。结果见表1O
表1受试品对二甲苯所致ICR小鼠耳壳急性炎症的影响
组别动物数（只）开始体重（g）右耳重（mg）左耳重（mg）肿胀度（mg）平均肿胀抑制率（％）空白对照1624.9±2.211.44±2.6416.54±1.2/  2.21±2.22**-
模型对照1624.5±1.221.44±3.3111.54±2.92/92±2.74-
受试品组1624.3±1.315.5。±3.3911.21±1.71  4.29±2.79**56.5
*P<2.25,**P<2.21，与模型对照组比较。
由表1可见，在本实验条件下，二甲苯作用1小时后，肉眼可见模型组小鼠左耳红肿、增厚明显；在二甲苯作用1小时期间，间隔三次给药后，与模型组（给予生理盐水）比较，受试品组对二甲苯所致小鼠耳壳炎性肿胀有56.7%的抑制作用，肿胀度与模型对照组比较有显著统计学差异（P<2.21）o
2.2组合物对小鼠断尾出血的止血作用比较研究
取SPF级雄性ICR种小鼠，挑选体重22~25g 合格动物，按体重随机分组，随机均分为2组：空白对照组、受试品组，每组16~16只。以尾部浸泡接触法给药，将小鼠固定于小鼠筒中，尾尖部2cm浸泡于402以的受试品溶液或生理盐水中，给药时间32分钟，间隔4小时后，重复给药1次。末次给药32分钟后，以利剪在小鼠距尾尖1.5cm处剪断，待血液自然流出时开始计录出血时间，每隔12s用事先已称重的棉球吸取血滴，直至出血自然停止（棉球吸时无血），1/万天平上称量带血棉球重量。按下式计算各组动物出血量：
出血量=带血棉球重量-初始棉球重量（毫
克）
实验结果用均数土标准差表示，采用SPSS17软
件One-Way  ANOVA 分析进行组间差异的显著性 检验。结果见表2。
表2
受试品对清醒小鼠断尾出血的影响
组别
动物数（只）
体重（g ）出血时间（秒）
出血量（mg ）空白溶媒12
23. 6 ±1.3127. 5 ±33.1
64. 6 ±646
受试品组
123. 6 ±1.3
80. 4 ±45. 6*47. 6 ±34 6
*P<7.75, * *P<7.71，与溶媒对照组比较。
由表3可见，药后1 ~4天期间，受试品组口腔 溃疡面积与同期溶媒对照组比较有相应减小，第4
天减小明显（P<7. 61）；同时受试品组口腔溃疡完
全愈合时间也明显小于溶媒对照组（P  <7. 71）。结
果表明受试品对豚鼠口腔腔溃疡具有明显的作 用。
24组合物对家兔口腔溃疡的作用比较
研究
[12]
取健康雄性家兔，适应性喂养5天后挑选体重
2 ~ 3kg 合格动物，用乙醚将其麻醉后，用内径为
7.7cm，长为3cm 的塑料管垂直固定于家兔口腔粘
膜表面，在管内放入充分浸润了 95%苯酚溶液的棉
签，于造模后24小时，测量动物口腔溃疡面积并随
机分为空白溶媒组、受试品组。用医用棉签分别浸
润受试样品后、充分涂抹每只动物口腔溃疡局部、并 保持药棉与溃疡面接触66秒，每天上下午各给药1 次，连续给药直至每只动物口腔溃疡完全愈合。空
白溶媒组同法给予生理盐水。实验中前5天期间，
*P<7.79，与溶媒对照组比较。
十七届三中全会公报由表2可见，与空白溶媒对照组比较，受试品对 清醒小鼠断尾出血时间有明显缩短（p< 7.75），受 试品对清醒小鼠断尾出血量均值有减少的倾向。
2.3 组合物对豚鼠口腔溃疡的作用比较 研究[5_11]
取健康雄性豚鼠，适应性喂养5天后挑选体重 207 ~307g 合格动物，用乙醚将豚鼠麻醉后，用内径
7. 6cm 、长3cm 的塑料管垂直固定于豚鼠口腔粘膜
表面，在管内放入充分浸润了 40%冰醋酸的棉签,
67秒后将棉签和塑料管取出，并迅速用水冲洗创面
1分钟。于造模24小时后，测量动物口腔溃疡面
积，并按随机分为空白溶媒组、受试品组。用医用棉
签分别浸润受试样品后、充分涂抹每只动物口腔溃
疡局部、并保持药棉与溃疡面接触60秒，每天上下
午各给药1次，连续给药直至每只动物口腔溃疡完 全愈合。空白溶媒组同法给予生理盐水。实验中前
5天期间，每天盲法测量动物口腔溃疡面积，按下式 计算给药后溃疡面积变化百分率：
溃疡面积变化百分率=Sx/ S o  x  107%
其中,S 。为给药前溃疡面积（mm 2）,S/为给药
后各天溃疡的面积（mm 2）。
实验结果用均数土标准差表示，采用SPSS15. 6
软件One  - Way  ANOVA 分析进行组间差异的显著
性检验。
本实验观察发现：44%冰醋酸可致豚鼠口腔面 颊侧粘膜急性炎症反应，在粘膜局部可见明显的红
肿、黄白假膜、继而粘膜坏死、脱落，形成溃疡面。 口腔溃疡造模后，每日2次局部给予不同受试品，每
在职研究生报考条件与要求
日观察动物口腔溃疡面积的变化情况，并记录每只
豚鼠口腔溃疡的愈合时间。结果见表3。
表3
受试品对豚鼠实验性口腔溃疡的作用
组别
动物数（只）
体重（g ）
药前溃疡
面积（mm 2）药后溃疡面积变化率（％）
口腔溃疡
愈合时间（天）
开始结束1天2天3天4天空白溶媒8
264 ±29267 ±24
15. 7 ±3.64162±18624262±46528. 5 ±1762362±862765±162
受试品组
7254±24
252 ±2715. 6 ±4. 6
5468±1565
29. 6 ±17. 7
15. 9 ±15.4
563±767
**
5.3 ±2.5**
每天盲法测量动物口腔溃疡面积、观察溃疡感染程
qiaorenliang
度并参照表4标准评分。
表4 口腔溃疡表面感染情况评分标准
分 值
溃疡表面感染情况_______________
0 无溃疡，口腔黏膜正常1
有溃疡，溃疡表面无明显假膜
2
溃疡表面有薄的一层黄白假膜，周围无水肿
3 溃疡表面假膜较厚，且周围伴有炎性水肿4
溃疡表面假膜厚，周围伴有明显炎性水肿
按下式计算给药后溃疡面积变化百分率：
溃疡面积变化百分率=S/S 。
x  107%
其中，S 为给药前溃疡面积（mm 2）,S/为给药
后各天溃疡的面积（mm 2）。
实验结果用均数土标准差表示，采用SPSS19软 件One-Way  ANOVA 分析进行组间差异的显著性
检验。
在本实验中，苯酚所致家兔口腔溃疡模型中，溃
疡周围充血严重、溃疡表面可见明显感染情况。口观察动物口腔溃疡面积及感染程度的变化情况，并腔溃疡造模后，每日2次局部给予不同受试品，每日记录每只家兔口腔溃疡的愈合时间。结果见表0o
表0受试品对日本大耳白兔口腔溃疡的作用
组别
动物
（只）
体重（g）药前溃疡
面积（mm2）
药后溃疡面积变化率口腔溃疡感染程度口腔溃疡
愈合时间（天）开始结束1天2天3天4天药前药后4天
空白溶媒7  2.2±0.2  2.5±0.530.0±4.0YIHO/4708±80439520.227.3±9.3  4.0±0.0203±10707±10
受试品组8  2.0±0.2  2.2±0.136.0±0.240.5±13.5
**29.9±16.3
*18.0±n.0
**8.0±8.0**  4.0±0.006±07**00±20** *P<0.05,**P<0.01，与溶媒对照组比较。
由表0可见，药后1~4天期间，受试品组口腔溃疡面积与同期溶媒对照组比较均有明显的减小（卩小乂厶或P<0.01）o给药前，溶媒对照组与给药组的口腔溃疡感染程度评分均为最高值4.0，组间没有差异（P>  2.80）；局部给药4天后，受试品组的口腔溃疡感染程度有非常显著改善（P< 0.01）o此外，由表5可见，与溶媒对照组比较，受试品组的口腔溃疡愈合时间有明显缩短（P<0.01），受试品组与溶媒对照组比较有显著差异。本结果表明受试品对家兔口腔溃疡具有明显的作用。
2.5组合物对大鼠牙周炎效果的研究[13-17]
2.5.0大鼠牙周炎模型制作
22只大鼠，腹腔注射1%水合氯醛麻醉、固定于鼠板上，用正畸钢丝缠绕在M2磨牙颈部并尽量使其陷入牙周袋，术后饲养，造模动物自由饮用1%高糖水（称取白砂糖若干，按计量用超纯水溶解即得），使其形成牙周炎。空白对照组，不造模自由饮用纯水。造模组在确认大鼠已形成牙周炎后，按规定进行给药。
2.5.2模型确认及给药方法
造模4周后，经牙周炎临床指标检测，确认牙周的探诊深度大于1mm的动物为模型建立成功动物，挑选1只模型动物，麻醉后取出钢丝、SD雄性大鼠SPF级,8周龄，体重217±17g，随机分2组，加上最初选入的空白对照组，共计3组：受试品组每日上、下午牙龈局部涂抹给药（给药剂量同上述实验受试品组），空白对照与模型对照组动物同法给予纯水。连续给药5周。给药前、给药2周和5周时，水合氯醛麻醉大鼠后，由牙医检测大鼠牙周临床指标，包括动物牙周的探诊深度（probing depth,PD）、龈沟出血指数（sulcas bleeping index,S BI）、牙龈指数（gingival index,GI）、菌斑指数（plaqueindex,PLI）。
2.5.3探诊深度（probing depth,PD）
探诊深度是重要的牙周临床指标，使用牙周探针测定牙周袋的深度，龈缘至龈沟底的距离即探诊深度。
检查方法：用牙周探针与牙长轴平行检查大鼠牙周袋深度，探察麻醉大鼠的左上颌M2磨牙近中、腭、远中三个位点的深度，取其平均数。结果见表6o 表6受试品对大鼠牙周探诊深度的影响
组别动物数（只）-
牙周袋深度（mm）
给药前给药后2周给药后5周
空白对照组90.20±0.000.19±0.020.1±0.00
模型对照组9  1.02±0,000.68±0.080.58±0.00
受试品组9  1.04±0,060.58±0.H*0.42±0.1** *P<0.00,**P<0.01，与模型对照组比较。
2.0.4龈沟出血指数（sulcau bleeping index, SB））
在患有牙龈炎时牙龈一般有红肿、出血现象发生，龈沟出血是牙龈炎活动期的表现，根据龈沟出血情
况对牙龈进行评价，能反应牙龈炎的活动状况，龈沟出血情况用龈沟出血指数表示。
检查方法：用牙周探针轻轻探至龈缘下方并滑动，观察牙龈出血程度，按下述评分标准计分。检查时探察大鼠的左上M2近中、腭、远中3个位点，取均数。评分标准：0=用牙周探针轻探不出血，牙龈外观健康无红肿;1=用牙周探针轻探不出血，牙龈略红肿，有轻度炎症;2=用牙周探针轻探牙龈呈点状出血，牙龈外观有颜改变和水肿;3=用牙周探针轻探牙龈出血沿龈缘扩展，牙龈有明显肿胀;4=用牙周探针轻探牙龈出血溢出龈缘，呈重度炎症，牙龈有明显肿胀;5=自动出血，牙龈有颜改变和明显肿胀，有时有溃疡。结果见表7。
**P<0.01，与模型对照组比较。
表7受试品对大鼠龈沟出血指数的影响
组别动物数（只）
龈沟出血指数
给药前给药后2周给药后5周
空白对照组9000
模型对照组9  2.00±0.25  1.01±0.800.52±0.30
受试品组9  2.05±0.310.82±0.320.^±0.25**
2-5-2牙龈指数（gingival index,GI）
牙龈指数是观察牙龈状况，检查牙龈颜和质的改变以及出血倾向的评定指数。
检查方法：使用钝头牙周探针，检查左上颌M2磨牙周围牙龈的近中唇（颊）乳头、正中唇（颊）缘、远中唇（颊）乳头和舌侧龈缘，分别按下述评分标准评分并取其平均数。评分标准：0=牙龈健康，无红肿、出血;1=有轻度炎症，探针轻探不出血。牙龈有颜改变和轻度水肿;2=有中度炎症，探针轻探出血，牙龈红肿;3=有重度炎症，有自动出血倾向，牙龈明显红肿或有溃疡。结果见表7o
表6对大鼠牙龈指数的影响
组别动物数（只）
牙龈指数
给药前给药后2周给药后5周
dnf鬼泣用什么武器好
空白对照组4222
模型对照组42,22±2,41  1.32.422,52±2.35
受试品组42,23±4.392,75±2.34  2.15±2.32*
*P<2.25，与模型对照组比较。
2.5.6菌斑指数（plaqueindex,PLC）[16]
根据牙菌斑的情况衡量牙周病的和预防效果，根据菌斑的厚度作为记分依据。操作方法：先用棉球蘸纯水轻擦拭大鼠牙齿以清洁口腔，再用棉球蘸取碱性品红染剂擦拭左上颌M2磨牙，染后再用干燥棉球吸干牙面多余染液。染完成后使用牙科探针在大鼠的左上颌M2磨牙龈沟内、龈缘及邻近牙面轻轻划过检查是否能刮出菌斑。依照此法对左上颌M2磨牙，做近中、远中、颊和舌四个面的检查并按照下述评分标准计分，取其平均值。评分标准：0=龈缘及邻近牙面无菌斑;3=肉眼视诊龈缘及邻近牙面无菌斑，探针尖划过时可刮出菌斑;2=龈缘及邻近牙面有中等量的菌斑;3=龈沟内和龈缘及邻近牙面有大量菌斑。结果见表4o
表4对大鼠菌斑指数的影响
组别动物数（只）-
菌斑指数
给药前给药后2周给药后5周
空白对照组4  3.32±2.n  3.33±2.151222±2211
模型对照组4  1.04±2.34  3.33±2.14  1.21±2.16
受试品组4  1.23±2.H1222±22152,75±2.14** **P<2.M，与模型对照组比较。
上述实验结果表明，受试品对牙周炎大鼠，牙周探诊深度、牙龈出血指数、牙龈指数、牙菌斑指数均有良好的改善效果，各项指标均有显著性差异（P< 2.25或P<2.21,）说明该组合物对大鼠牙周炎的缓解和是有效的。
依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T 322.2-2216要求，对云南白药活性肽牙膏进行了临床观察试验，本试验参加人数共计73人，其中5人因没能参加定期的检查，退出试验观察,68人参加完成整个临床试验。其中年龄分布为18~74岁, 32-55岁人员占比为75%o
3临床试验观察方案[16]
3.1试验设计
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试验采用盲法、随机、对照观察的临床研究方法。试验样品分别为云南白药活性肽牙膏、不含云南白药提取物和美洲大蠊提取物相同基质的牙膏（空白对照牙膏）
3.2试验期限
3-2.1在试验前医生需先对受试者进行口腔状况检查，筛选出符合试验要求的患者进入试验O
3.2.2试验用产品使用期限为3个月。
3.2.3每名受试对象共需接受3次口腔检查，第1次为筛选受试者并进行刷牙方法指导，对受试者各项观察指标进行记录并进行随机分组，开始使用牙膏进入试验观察；产品按要求使用一个月后进行第2次检查并对各项指标进行记录；第3次检查为使用牙膏3个月后并对各项指标进行记录。
3-2.4每次复查后发给受试对象2-3支优质软毛牙刷和足量的试验样品牙膏；要求受试对象每天至少用该牙膏刷牙2次，每次一分钟以上，并用所发牙刷刷牙。要求所有受试者必须进行巴氏刷牙法的指导。
3-3试验对象
受试者为符合纳入及排除标准的患有牙龈炎或慢性牙周炎（轻度及中度）的成年男性和女性，一般情况试验人每组数量应不少于32人。
3-4纳入标准
牙龈炎或慢性牙周炎轻度及中度患者。
全身健康状况良好、无重要的全身系统性疾病、有22颗以上可检测的牙齿。
年龄在3~74周岁。
如果为女性，不得处于妊娠期和哺乳期内。林心如陈键锋
受试者应具有适当程度的菌斑或牙龈炎。
没有同时参加其他类似试验研究。
签署知情同意书，能按要求完成临床试验。
3.2排除标准
对试验产品成份有过敏史。
现在服用对试验结果有影响的药物。