建立与评价
张旭东１，李泽平１，王㊀琪１，李玉彬１，秦伟涛１，段学军２
(１．北京北方生物技术研究所有限公司，北京１０００７６;２．中国同辐体外诊断研发中心，北京１０００７６
)D O I :１０．１１７４８/b j m y ．i s s n ．１００６－１７０３．２０２１．０５．０３０收稿日期:２０２１Ｇ０３Ｇ２０；修回日期:２０２１Ｇ０４Ｇ０１基金项目：中核集团 青年英才 项目
作者简介：张旭东(１９８５ )
，工程硕士，高级工程师，主要从事免疫诊断试剂研发，中核集团 青年英才 项目负责人.通讯作者：段学军(１９７１ )
，分析化学博士，高级工程师，主要从事免疫诊断试剂研发，中国同辐免疫诊断方向特聘首席专家.摘要：目的㊀建立基于酶联免疫法(e n z y m e Ｇl i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y ,E L I S A )双抗原夹心法和竞争抑制法的新型冠状病毒(S A R S ＧC o V Ｇ２)中和抗体检测方法，并评价两种方法的检测性能.方法㊀使用基因重组刺突蛋白受体结合域(s p
i k e p r o t e i n r e c e p t o r b i n d i n g d o m a i n ,S ＧR B D )作为包被抗原，辣根过氧化物酶(H R P )标记另１株基因重组蛋白S A R S ＧC o V Ｇ２S ＧR B D ，建立S ＧR B D 双抗原夹心法.使用基因重组人血管紧张素转化酶２(a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m e ２,A C E ２)作为包被抗原，辣根过氧化物酶(H R P )标记S ＧR B D 蛋白，建立竞争抑制法.优化各自的反应体系，使整个系统达到最佳检测性能，并对两种检测方法进行对比评价.结果㊀两种方法的灵敏度相近，临界值附近的重复性夹心法为７．５１％，竞争抑制法为１０．７０％；未接种疫苗且核酸阴性的人样本，两种方法的特异性均为１００％;
已接种疫苗的人样本，夹心法的阳性检出率为７５．０％，竞争抑制法为７１．４％，与金斯瑞生物科技股份有限公司生产的新冠病毒中和抗体检测试剂盒(E L I S A )的检测结果相比,K a p p
a 指数分别为０．９㊁０．８１，差异均无统计学意义(P ＞０．０５).结论㊀成功建立新型冠状病毒(S A R S ＧC o V Ｇ２)中和抗体双抗原夹心法和竞争抑制法两种酶联免疫检测方法，夹心法的重复性优于竞争抑制法.两种检测方法与已上市的同类产品的差异没有统计学意义，具有一定的临床应用价值.关键词：新型冠状病毒;㊀中和抗体检测;㊀酶联免疫法中图分类号:R ３７３．９㊀㊀文献标识码:A
T h eE s t a b l i s h m e n t a n dE v a l u a t i o no fT w oM e t h o d s f o r t h eD e t e c t i o n
o f S A R S ＧC o V Ｇ２N e u t r a l i z i n g A n t i b o d y
Z H A N G X u d o n g １,L IZ e p i n g １,W A N G Q i １,L IY u b i n １,Q I N W e i t a o １,D U A N X u e j
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(１．B e i j i n g N o r t hI n s t i t u t eo fB i o t e c h n o l o g y C o ,L t d ．,B e i j i n g １
０００７６,C h i n a ;２．C h i n a I s o t o p e&R a d i a t i o nC o r p o r a t i o n I n n o v a t i o nC e n t e r o f I V D ,B e i j i n g １
０００７６,C h i n a )A b s t r a c t :O b j e c t i v e I nt h i ss t u d y ,t w oS A R S ＧC o V Ｇ２n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y d
e t e c t i o n m e t h o d s w e r e e s t a b l i s h e db a s e do nt h e p r i n c i p l eo fd o u b l ea n t i g e ns a n d w i c h m e t h o da n dc o m p
e t i t i v ei n h i b i t i o n m e t h o do n t h eE n z y m e ＧL i n k e d I m m u n o S o r b e n tA s s a y ,a n d t h e e
f f e c t i v e n e s s o f t h e t w om e t h o d sw a s e v a l u a t e d ．M e t h o d s I nt h eS ＧR B D d o u b l ea n t i
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E n z y m e ２(A C E ２)w a s a p p l i e d a s t h e c o a t i n g a n t i g
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鼻炎的正确治法怎么治
s t e m ,t h et w od e t e c t i o n m e t h o d sh a dt h eb e s td e t e c t i o n p e r f o r m a n c e ．T h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e t w od e t e c t i o nm e t h o d sw a s e v a l u a t e du s i n g v
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i t i v ei n h i b i t i o n m e t h o d．T h er e p e a t a b i l i t y o ft h ed o u b l e a n t i g e ns a n d w i c h m e t h o di sb e t t e rt h a nt h a to ft h ec o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n m e t h o d．T h e r ei sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e nt h et w o d e t e c t i o n m e t h o d sa n ds i m i l a r p r o d u c t so nt h e m a r k e t, s u g g e s t i n g t h a t t h e y h a v e c e r t a i nc l i n i c a l a p p l i c a t i o nv a l u e s．
K e y w o r d s:S A R SＧC o VＧ２;㊀N e u t r a l i z i n g a n t i b o d y;㊀E n z y m eＧl i n k e d i mm u n o a s s a y
㊀㊀２０２０年３月，由一种新型冠状病毒S A R SＧC o VＧ２引发的新型冠状病毒肺炎(C O V I DＧ１９)疫情被世界卫生组织(WH O)认定为大流行病[１].S A R SＧC o VＧ２属于冠状病毒科㊁β冠状病毒属，是一种球形的单正链核糖核酸(R N A)病毒.该病毒具有磷脂双分子层包膜，直径１００n m左右；包膜内有核衣壳蛋白(n u c l e o c a p s i d p r o t e i n,N蛋白)；包膜上有膜蛋白(m e m b r a n e p r o t e i n, M蛋白)㊁套膜蛋白(e n v e l o p e p r o t e i n,E蛋白)和刺突糖蛋白(s p i k e p r o t e i n,S蛋白)[２Ｇ３].S蛋白介导冠状病毒进入宿主细胞，其包括两个功能亚基，分别是负责与宿主细胞的血管紧张素转化酶２(a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n g e n z y m e２,A C E２)受体结合的S１亚基和负责与细胞膜融合的S２亚基，因此，冠状病毒的S蛋白是抗病毒中和抗体的重要靶点[４].中和抗体主要通过与受体结合域(r e c e p t o r b i n d i n g d o m a i n,R B D)的相互作用来阻断S蛋白与A C E２结
合.
㊀㊀中和抗体与人体对S A R SＧC o VＧ２的免疫力，或病毒感染后发病程度密切相关.有研究表明，恢复期的血清中含有的中和抗体可在感染后清除病毒方面发挥相关作用[５Ｇ６].人体获得中和抗体的主要途径有 自然 感染㊁血浆疗法以及免疫接种S A R SＧC o VＧ２疫苗３种.目前，国内外大部分非灭活疫苗均选择使用新冠病毒的S蛋白作为抗原，通过诱导机体产生强大的病毒特异性中和抗体和T细胞反应，从而针对S A R SＧC o VＧ２产生持久的保护作用.有研究[７]报道, 自然 感染患者在出院８周之后，无症状感染者中８１．１％显示中和抗体水平下降，有症状感染者中６２．２％的患者中和抗体水平下降.另外，与所有的疫苗一样，由于个体免疫应答系统的差异，接种S A R SＧC o VＧ２疫苗也并非能提供１００％的保护力.因此，检测中和抗体对于患者免疫力或疫苗接种效果的评价，具有一定的研究意义.
材料和方法
㊀㊀１㊀材料
㊀㊀１．１㊀主要材料和试剂㊀包被用新冠病毒基因重组蛋白SＧR B D购自菲鹏生物股份有限公司，包被用A C E２蛋白购自武汉全臻生物科技有限公司，标记用SＧR B D蛋白购自武汉全臻生物科技有限公司；辣根过氧化物酶购自S i g m a公司;９６孔微孔板购自深圳市金灿华实业有限公司；新生牛血
清(B S)㊁牛血清白蛋白(B S A)购自兰州民海生物工程有限公司；其他化学试剂为国产分析纯；新冠病毒中和抗体人源化重组单抗来源于菲鹏生物股份有限公司；质控基质血清来源于宝德康体(北京)生物科技有限公司(２０１８年生产批次)；临床血清样本来源于北京中同蓝博临床检验所；对照试剂为取得美国F D A应急使用授权(E U A)的新冠病毒中和抗体检测试剂盒(E L I S A)，生产商为金斯瑞生物科技股份有限公司.㊀㊀１．２㊀仪器㊀检测系统S MＧ３型全自动酶标仪，洗板机Z M X９８８B，均为北京天石天力医疗器械技术开发中心生产.
㊀㊀２㊀方法
㊀㊀２．１㊀固相板的制备㊀①SＧR B D抗原包被板：基因重组蛋白SＧR B D用０．０５m o l/L p H９．５的碳酸盐缓冲液稀释至０．５㊁１㊁２㊁４μg/m L，加入１００μL/孔,２~８ħ包被２４h.弃去包被液，加入含０．５％B S A的封闭液,３７ħ封闭２h，弃去封闭液，室温晾干备用.②A C E２抗原包被板：基因重组A C E２蛋白用０．０５m o l/L p H９．５的碳酸
盐缓冲液稀释至１㊁２㊁４㊁８μg/m L，加入１００μL/孔,２~８ħ包被２４h.弃去包被液，加入含０．５％B S A的封闭液,３７ħ封闭２h，弃去封闭液，室温晾干备用.
㊀㊀２．２㊀酶标抗原的制备㊀采取改良过碘酸钠法[８].１m g辣根过氧化物酶中加入１m g的过碘酸钠作用３０m i n后，再加入１００μL１％乙二醇作用３０m i n，然后加入１m g基因重组蛋白SＧR B
D，混匀后对０．０５m o l/L碳酸盐缓冲液透析过夜，加入硼氢化钠后，加入饱和硫酸铵溶液离心，弃去上清液，用０．０２m o l/LP B S缓冲液复溶后透析２d.
㊀㊀使用含２０％新生牛血清的０．０２m o l/LP B S缓冲液，将酶标抗原按体积比１ʒ５００㊁１ʒ１０００㊁１ʒ２０００㊁１ʒ４０００㊁１ʒ８０００㊁１ʒ１６０００稀释，作为酶标SＧR B D 工作液.
㊀㊀２．３㊀对照品的配制㊀选择质控基质血清作为阴性对照品(N c)；选择质控基质血清稀释的中和抗体单抗浓度０．５μg/m L作为阳性对照品低值(P c１),５μg/m L作为阳性对照品高值(P c２).
㊀㊀２．４㊀质控品的配制㊀选择１份金斯瑞试剂盒检测为强阳性的疫苗接种者血清，以及５份检测为阴性的正常人血清.使用正常人混合血清对强阳性血清进行梯度稀释，将测值为金斯瑞c u t o f f值１．１倍的浓度定义为L１，再稀释１倍的浓度定义为L２，正常人混合血清定义为L３.L１~L３即为最低检测限质控品，要求至少L１检出阳性,L３应为阴性.另配制３倍c u t o f f值浓度的样本作为重复性质控.宁波中考查分
㊀㊀２．５㊀中和抗体检测方法的建立㊀①双抗原夹心法：采用SＧR B D包被板作为固相板，依次加入阴性对照品㊁阳性对照品和待测样本５０μL/孔，贴上封板膜,３７ħ孵育３０m i n；洗板机洗板３次，加入酶标SＧR B D工作液５０μL/孔,３７ħ孵育３０m i n；洗板机洗板３次，加入显剂A液㊁B
液各５０μL/孔,３７ħ孵育１５m i n；加入终止液５０μL/孔，用酶免仪检测各孔吸光度O D值.O D值的高低与样本中和抗体的含量呈正相关.②竞争抑制法：采用A C E２包被板作为固相板，依次加入阴性对照品㊁阳性对照品和待测样本５０μL/孔，酶标SＧR B D工作液５０μL/孔，贴上封板膜,３７ħ孵育３０m i n；洗板机洗板３次，加入显剂A液㊁B液各５０μL/孔,３７ħ孵育１５m i n；加入终止液５０μL/孔，用酶免仪检测各孔吸光度O D值；计算抑制率＝１－样本O D值/阴性对照O D值.抑制率的高低与样本中和抗体的含量呈正相关.
㊀㊀２．６㊀阳性判断值的确定㊀参考中华人民共和国卫生部发布的临床实验室检验项目参考区间的制定[９]，分别建立两种检测方法的参考值.
㊀㊀２．７㊀检测方法的性能评价㊀①最低检测限：检测经金斯瑞生物科技股份有限公司试剂盒标定的质控品L１~L３，根据阳性判断值判断阴阳性,L１应为阳性,L２应为阴性或阳性,L３应为阴性.②重复性：平行检测１０次重复性质控(n＝１０)，计算O D值的均值(x)与标准差(s)，求得变异系数(C V)＝s/xˑ１００％.
③热稳定性：将固相板真空密封，液体组分加防腐剂分装后,３７ħ恒温放置６d后，对上述指标重新进行检测，观察各项指标的变化.④H O O K效应：使用质控基质血清，将中和抗体单抗稀释至０．０２㊁０．２㊁２m g/m L 三个浓度.检测是否出现高浓度倒钩现象.
㊀㊀２．８㊀临床应用初步评价㊀①阴性符合率：检测核酸结果为阴性，且未接种疫苗的正常人体检血清样本，计算阴性样本符合率.②阳性符合率：与金斯瑞生物科技股份有限公司试剂盒同时检测接种新冠疫苗第二针两周后的献血员血清样本，分别计算两种检测方法与金斯瑞生物科技股份有限公司试剂盒检测结果的一致性.
㊀㊀３㊀统计学处理
㊀㊀所有数据均采用E x c e l２００７或S P S S１９．０软件进行分析;P＜０．０５为差异有统计学意义.
结㊀㊀果
㊀㊀１㊀方法学建立
㊀㊀１．１㊀包被抗原最适浓度的选择兔年是什么年
㊀㊀１．１．１㊀夹心法SＧR B D最适浓度的选择㊀使用不同浓度的包被板，分别检测阴性对照品和阳性对照品，计算O D值的比值P c/N c.随着包被浓度的增加，阳性对照品的吸光度O D值和P c/N c都逐渐增大，至２μg/m L后趋于平衡,P c/N c变化不大(图１).因此选择SＧR B D的最适包被浓度为２μg/m L .
图１㊀夹心法SＧR B D不同包被浓度下阳性
对照品O D值和P/N值
㊀㊀１．１．２㊀竞争法A C E ２最适浓度的选择㊀使用不同浓度的包被板，分别检测阴性对照品和阳性对照品，计算抑制率.随着包被浓度的增加，阳性对照品的吸光度O D 值逐渐升高，抑制率逐渐降低，其中阳性对照高值(P c ２)的O D 值和抑制率自２μg /m L 后趋于平衡(图２).因此选择A C E ２的最适包被浓度为２μ
g /m L .图２㊀竞争法A C E ２不同包被浓度下阳性
对照品O D 值和抑制率
㊀㊀１．２㊀酶结合物最适浓度的选择
㊀㊀１．２．１㊀夹心法酶结合物最适浓度的选择㊀使用不同浓度的酶标S ＧR B D 工作液，分别检测阴性对照品和阳性对照品，计算O D 值的比值P c /N c .随着酶结合物浓度的降低，阳性对照品的吸光度O D 值逐渐降低,P c /N c 自１ʒ１０００后显著下降.为保证检测方法灵敏度，选择夹心法的酶结合物最适浓度为１ʒ１０００.见图３
.
图３㊀夹心法S ＧR B D 不同酶浓度下阳性
对照品O D 值和P c /N c 值
㊀㊀１．２．２㊀竞争法酶结合物最适浓度的选择㊀使用不同浓度的酶标S ＧR B D 工作液,
分别检测阴性对照品和阳性对照品，计算抑制率.随着酶结合物浓度的降低，阳性对照品的吸光度O D 值逐渐降低，阳性对照高值(P c ２)的抑制率变化不大，阳性对照低值(P c １)的抑制率逐渐增加，至１ʒ８０００后趋于平衡(图４).因此选择竞争法的酶结合物浓度为１ʒ８０００
.
图４㊀竞争法A C E ２不同酶浓度下阳性对照品O D 值
和抑制率
核酸码在手机哪里查㊀㊀１．３㊀阳性判断值的确定
㊀㊀检测２０２份正常人体检样本,
经统计学分析，两种方法的检测结果均呈偏态分布.夹心法O D 值最高值为０．０９８，最低值为０．００１，中位数０．０２９，采用百分位数法计算９５．００％㊁９９．００％㊁９９．５０％的百分位数分别为
０．０５９㊁０．０８８㊁０．０９８；竞争法最高抑制率为２８．３％，最低抑制率为－１４．８％，中位数４．３％，采用百分位数法计算９５．００％㊁９９．００％㊁９９．５０％的百分位数分别为１８．４％㊁２４．２％㊁２８．３％.数据分布见图５
㊁图６
.
图５㊀双抗原夹心法正常人样本分析
图６㊀中和竞争法正常人样本分析
㊀㊀根据中国疾控中心的新冠血清流调[１０]显示，我国湖北之外六省份的１．２万余人中仅检测到２例抗体阳性，阳性率极低.因此，设定夹心法的c u t o f f值为０．１０５，竞争法的c u t o f f值为３０％，此时所有样本均可判为阴性.
㊀㊀２㊀试剂性能评价
㊀㊀２．１㊀灵敏度㊀检测经金斯瑞生物科技股份有限公司试剂盒标定的质控品L１~L３，结果如下表１.
表１㊀两种方法的灵敏度比较结果
项目
双抗原夹心法竞争抑制法O D值结果O D值结果
阴性对照０．０１２－２．５６３－
C u tＧo f f值０．１０５１．７９４
L１０．１４７＋１．４８４＋
L２０．０７２－１．９６６－
L３０．０１９－２．６３９－㊀㊀由上述结果可以看出，两种方法的灵敏度结果均符合规定要求.
㊀㊀２．２㊀精密度
㊀㊀平行检测１０次重复性质控(n＝１０)，计算O D 值的平均值和标准偏差，求得变异系数(C V).
表２㊀两种方法的精密度比较结果(n＝１０)
项目双抗原夹心法竞争抑制法寻味顺德
平均值０．５４９０．８２２
标准偏差０．０４１２０．０８８０
变异系数(％)７．５１１０．７０
有关端午节的诗句
㊀㊀上述结果可以看出，两种方法的变异系数均小于１５％，且夹心法优于竞争法.㊀㊀２．３㊀热稳定性
㊀㊀将两种方法的所有组分置于３７ħ恒温放置６d 后，取出后与４ħ保存的组分同时做对比，检测灵敏度与精密度.两种试剂３７ħ的检测性能均未出现明显的下降，稳定性符合要求，见表３.
表３㊀两种方法的热稳定性比较结果
项目
双抗原夹心法竞争抑制法
４ħ３７ħ４ħ３７ħL１＋＋＋＋
L２－－－－
L３－－－－
变异系数(％)７．０４７．８３９．８９１０．４１㊀㊀２．４㊀HO O K效应
㊀㊀使用质控基质血清，将中和抗体单抗稀释至０．０２㊁０．２㊁２m g/m L三个浓度.由于酶标仪
O D值存在上线，很难准确测定HO O K效应浓度的拐点，同时双抗原夹心法采取两步法反应，理论上呈现平台效应，不会出现 钩状效应 .
㊀㊀２．５㊀特异性
㊀㊀对１００例核酸阴性且未接种疫苗的正常人体检血清样本进行检测，两种检测方法的特异性均为１００％.
㊀㊀２．６㊀阳性符合率
㊀㊀对２８例接种疫苗人员的血清样本进行检测，自建两种方法与金斯瑞试剂盒的检测结果见表４.夹心法与金斯瑞的K a p p a指数为０．９，竞争法与金斯瑞的K a p p a指数为０．８１，经卡方检验三者差异无统计学意义(P＞０．０５).
表４㊀两种方法与金斯瑞试剂盒的检测结果检测试剂
中和抗体
阳性阴性
阳性检出率(％)双抗原夹心法２１７７５．０
竞争抑制法２０８７１．４
金斯瑞试剂２２６７８．６
讨㊀㊀论
㊀㊀中和抗体检测的金标准是病毒中和实验，但是该实验需要高度熟练的操作人员以及三级生物安全实验室，所以不适用于常规检测.血清学免疫检测试剂是病毒中和实验良好的替代品.Z HU等[１１]研发的以A d５为载体的新冠疫苗临床数据中，使用北
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