［摘要］2219年底，严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染疫情引起全球关注，已影响182多个国家和地区,2222年3月1)日，世界卫生组织(WHO)宣布将新型冠状病毒肺炎列为全球性大流行病。早诊断、早隔离、早可降低病毒传播的风险，因此快速准确的实验室诊断尤为重要。文章就严重急性呼吸综合征冠状病毒0的核酸检测和免疫学检测方法进行综述。
［关键词］严重急性呼吸综合征冠状病毒0；新型冠状病毒感染的肺炎；检测
［中图分类号］R51)［文献标志码］A［文章编号］1408A199(220))40-2225-04
［DOI］14G657)/j2nkiG008A199G42)G2G18
Research progress of detection methods for severe acute respiratory syndrome coronavirus2
HAN Yi-fann revieaing,ZHANG JinAni,WANG CUtn-Sti,ZHU Jin checking
(Department of Disease Prevention,and Controi.Centra foa Disease Control and Prevention,of Eastera Theata,Nanjing217002,Jiange ,China)
[AbshrcO]The opthreab and spreat of severe acote respim+ry syedromo coronavirus0(SARS-BoV-9)ic Wuhan ic Cp2419 has aroused gloSai at+ntion.Coronavirus disease2419(COVID-17)has swept into at Cast134couptries.Ox March1),2222,The World Health Oryanization decCreC the COVID-17viral disease is ts+d as a gloSai pandemic.Early and accomte diagoosis is Ro most criZcai s+p for quaran/oo ,disease control and treat+ent.Research progress of oucleic acid detec/on and immuPoCgicai de+c/on of SARS-FoV-9is reviewed ic this yaper.
［Key worUs］SARS-FoVA；COVID-17；dePcPon
0引言
2020年-月，科研人员检出一种区别于SARS 冠状病毒(SARS-FoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS-FoV)的新型冠状病毒，并获得全部基因组序列［。同年2月3月，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)将引起此次疫情的新型冠状病毒(2019a C ov)2］更名为严重急性呼吸综合征冠
状病毒9(SARS-FoV-2)，同日世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVIDA9”。同年2月28日世界卫生组织将此次疫情全球风险级别由此前的“高”上调至“非常高”。
COVIDA7患者主要临床表现为发热、干咳和乏力，无明显的特征性临床表现，与流感等呼吸道病毒
作者单位:217002南京，东部战区疾病预防控制中心［韩一芳(医学博士、、张锦海、汪春晖、朱进］性感染症状相似［3］。因此，特异灵敏的实验室检测对于COVIDA7的诊断十分重要。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，疑似病例的确诊主要依据实时荧光RTACR检测新型冠状病毒核酸阳性、病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源、血清新型冠状病毒特异性OM和OG抗体阳性以及血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及4倍以上升高。疫情暴发初期，核酸检测能力相对不足，随着筛查能力提升，核酸检测手段的可靠性也存在一些争议，如冠状病毒复制过程突变率和重组率高对核酸检测存在的可能影响；以及出院患者复诊核酸检测阳性是复发感染，还是采样影响，或是核酸检测漏检［］；随着免疫学检测和核酸检测的联合使用是否可规避上述问题。本文就SARS-FoV-9感染的实验室检测作一综述。
通信作者；朱进,E-mail:zhujinl968@njmt2tt2o
1SARS-CoV-2
SARS-FoV-9为单股正链RNA病毒(yoTt+v-sessa ssRNA vimses)，属套病毒目(NidoviraCs)冠状病毒科(Comnyviribna)冠状病毒属(Comnavims)0属，呈圆形或椭圆形，有包膜，直径62A40nm。基因组全长29993bp(GesBand accession number MN993946)，基因组排列顺序是5'-ORFlad-S-ORF3a-E-M-ORF6-ORF7a-ORF8-N-ORF10,5'端约2/3区域编码病毒RNA聚合酶蛋白，后1/3区域编码4个结构蛋
白，刺突蛋白(spike'S)、包膜蛋白(esvelopa,E)、膜蛋白(membrane,M)、核衣壳蛋白(ntcCocapsib,N)，以及一些非结构蛋白和辅助蛋白。SARS-FoV-9基因特征与a属人冠状病毒229E、NL63，及0属人冠状病毒OC43、HKU1、SARS-Cov(79%同源)和MERS-Fov(52%同源)均有明显区别，与中国浙江舟山蝙蝠体内分离得到的两株SARS样冠状病毒(GesBand accession nos. MG777933,772934)高度同源［s「2］。尽管多个科研
团队发现新冠病毒与蝙蝠携带的SARS相关病毒相似，且有报道与穿山甲携带的冠状病毒刺突蛋白受体结合区域基本相同，但北京大学陆剑与上海巴斯德所崔杰课题组近期研究结果提示，其可能的原因为趋同进化，更有意义的是比较基因组上的中性位点的差异，与基因组不同序列混为一谈分析相比，对于中性位点的比对显示新型冠状病毒与蝙蝠冠状病毒RaCGD的遗传距离要大很多，该课题组通过分子进化发现，新冠病毒已经演化出L和S两个亚型町。
2实验室诊断
传染病病原的诊断包括病原学诊断和血清学诊断，病原学诊断包括病原分离和病原核酸检测，而免疫学诊断分为抗原检测和抗体检测。新型冠状病毒病原分离需在生物安全3级实验室中进行，接种Vera E6和HuhA等细胞系培养需6天左右，该方法尚未纳入诊断标准。参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，确诊主要采取的实验室检测方法有：实时荧光定量RTACR检测新型冠状病毒核酸阳
性；病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；新型冠状病毒特异性OM抗体和IgG抗体阳性；新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及4倍以上升高。
22核酸检测
222卖时荧光RT-2CR检测呼吸道样本的实时荧光PCR(polymerasa chain reaction,PCR)检测是急性呼吸道传染病的常规检测手段，灵敏度高、特异性 好且在病原检测中应用成熟。此次新型冠状病毒突发公共卫生事件中，实时荧光RTACR检测法在早期诊断和筛查中都发挥了重要作用。目前市面上的核酸检测试剂盒及中国疾病预防控制中心和多个课题组发布的检测方法主要基于-端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团的TayMtn探针RT-PCR技术m。然而，由于新型冠状病毒与蝙蝠冠状病毒RaCGD在基因序列上有4%的差异，因此部分引物探针存在交叉反应，如香港大学公共卫生学院所公布的SARS-FoV-9引物探针与SARS-FoV和蝙蝠源SARS冠状病毒存在交叉反应，PCR阳性结果需经序列分析进一步区分［3。此外，因样本类型及采集时间、样本质量、样本运输保存时间与条件、仪器设备、试剂、人员操作方法因素等多方面影响，目前报道COVIDA7患者病毒核酸阳性检出率仅为30%~50%［14］，新型冠状病毒RTACR法核酸检测试剂对弱阳性样本存在漏检情况［)］。
自公布SARS-FoV-9基因序列以来，国家药品监督管理局已应急审批17个新型冠状病毒核酸实时荧光RTACR检测试剂盒，三类医疗器械注册证的病毒核酸检测试剂的研发，常规经临床验证、标准化生产
、质控等一整套流程，上市一般约三年。此次为满足疫情防控的需求，经应急通道特批的核酸检测试剂尚存在不稳定的因素，如低浓度样本假阴性，缺乏大规模临床样本验证等。有赖于免疫学检测等方法的补充以及后续的不断完善。
22.2等温扩增此次医疗诊治力量相对薄弱的城市在遭受严重疫情时，反应出防疫中对便携、快速检测设备的需求。由于实时荧光PCR需要依赖昂贵精密仪器，近年来环介导等温扩增(Cop-medmted isothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增(mcombinase polymerasa amplification,RPA)、依赖核酸序列的扩增技术和依赖解旋酶的恒温基因扩增技术等恒温扩增技术不断涌现，目前已报道的恒温扩增技术有十几种，在病原监测检测中得到了广泛的应用⑴-0。目前已报道的流感病毒、合胞病毒等呼吸道病原RTAAMP检测方法均有较好的灵敏度和特异性［12-14］，随着技术的发展，中东呼吸道综合征的RTAAMP结合可视化垂直引流条和探针的方法可较好的防止高效恒温扩增后造成产物气溶胶污染。博蒙特卫生系统提出新型冠状病毒的RTAAMP检测法在风险点可能实现更快、更便宜的现场检测⑷。成都信息工程大学叶松教授研究
团队拟研发基于微流控的即时检测(poidt-of-cyra testing,POCT)技术和LAMP技术的现场智能一体化快速新型冠状病毒核酸核酸检测系统。此次疫情中应急获批的博奥公司“六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)”基于lamp技术，能检测新型冠状病毒、甲型流感病毒通用，甲型流感病毒2007H1N1型、甲型流感病毒H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒六个靶标，不仅可区分正常人
和covia-19患者分开，还可区分易混淆的轻症新冠肺炎患者和流感患者，降低因诊断不明造成的人传人风险。
重组酶聚合酶核酸扩增的反应条件为23-45°C，反应时长只需5-20mis，特异性强、灵敏度高，特别是结合侧流层析的RPAN/D检测可通过肉眼观察检测线和质控线的颜来判断检测结果，适用于现场简单快速检测［250而重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)的出现，不仅使得重组酶等温扩增的成本降低，而且在病原检测中的广泛应用、不断优化推广［2「25］，此次疫情中RAA检测方法已纳入江苏省地方标准新型冠状病毒检测技术规范(DB32T3762.2-2222)0但该方法尚未列入国家标准指南，尚不能作为实验室诊断标准。近期美国雅培公司研发的COVIA-19测试工具ID NOW tm是一种快速、基于仪器和切口酶恒温扩增技术的检测系统，最快可在5min内获得阳性结果，阴性结果确认也仅需18mix，目前该检测工具已获得美国食品和药物管理局紧急批准。2.13测序新型冠状病毒肺炎诊疗方案试行版一直将高通量测序列入确诊病例的检测方法。高通量测序技术又名第二代测序(yext-seseration seques-cing,NGS)，单次并行测序可达几十万到几百万条DNA分子［26］02010年基于二代测序技术的病原宏基因组测序确诊钩体病后［/，病原宏基因组测序广泛应用于未知病原体鉴定、罕见重要病原体诊断和临床大数据分析等卩524］0
高通量测序是早期不明原因肺炎阶段明确病原的关键技术，也是监测新型冠状病毒突变的重要手段［(］。但是NGS序列读长较短,Illuming平台为257-390by,452平台最长500Op左右［29］0NGS建库
前需通过PCR富集序列，含量较少的序列有可能无法被扩增而导致信息丢失，且PCR存在引入错配碱基的可能。
第3代测序为单分子测序，基于SMRT技术(PocBio公司)和纳米孔单分子技术(Oxford Nana-pora Tec/yo/piss公司)等，运行速度快，数据可实时监测，建库过程无需PCR扩增即可以测定长度在数万个碱基的核酸序列。而近来有学者报道对已知病原结合多重PCR后进行三代测序，有助于快速获得病毒基因组全长［-］0此外，三代测序技术创新性的实现了RNA直接测序［5)-32］03月5日，澳大利亚科学家发表了首例使用纳米孔技术对SARS-PoV-S的直接RNA测序研究，RNA直接测序数据还有助于识别病毒中可能存在的修饰影响宿主-病原体相互作用和病毒复制的碱基修饰。英国学者10h内基于三代测序获得SARS-PoV-S基因组，进一步通过非序列依赖单引物(SISPA)宏基因组测序分析识别与其他细菌和病毒混合感染的信息［5］0尽管测序精度高，可获得全面的基因组数据有助于深度解读SARS-PoV-S的来源、病毒突变等问题，但测序结果的判定依赖专业人员较长时间的生物信息学分析，且测序流程复杂、专业性强、检测时间相对较长，难以大范围推广开展快速诊断［3°0
2.13其他核酸检测技术随着科技的发展和多学科的融合，数字PCR技术、基因编辑技术、核酸POCT技术和核酸质谱技术等核酸检测技术不断涌现［50如中国计量科学研究院研发并发布了高灵敏度的新型冠状病毒数字PCR法核酸检测试剂盒；麻省理工学院的张锋研究团队研发了基于CRISP-Casl3技术的新型冠状病毒检测试剂盒［4；Nguyen等⑶］利用CRISP-Casl3d基因编辑系统靶向探索可能的新型
冠状病毒感染方案；多家企业还在研发整合核酸扩增、信号收集与结果分析功能的新型冠状病毒核酸POCT平台；此外，还有公司利用飞行时间质谱法技术开发了“常见呼吸道病毒及新型冠状病毒核酸检测”，检出限为-5拷贝数/mLo
尽管核酸检测是目前广泛使用的检测金标准，但核酸检测的样本前处理需要在生物安全实验室内进行［-］，并不十分适用于床旁检测及现场快速筛查。使用含裂解液的病毒采样管灭活病毒，结合可在37C进行反应的恒温扩增方法是否有望实现简便一体化的核酸提取与检测仍有待进一步研究。
23免疫学检测法免疫学检测包括对抗原的检测和对抗体的检测，SARS-PoV-S表面的S蛋白、N 蛋白等可作为抗原表位［-］，已有公司发布基于胶体金免疫层析法的2210-sCoV新型冠状病毒抗原检测试剂以及基于纳米颗粒显技术和双抗体夹心的新型冠状病毒蛋白快速检测检测试剂盒，可在咽拭子、痰液和血液中检测到SARS-PoV-S抗原。尽管重组抗原相对快速，但是选择最佳抗原需要时间和大样本
试验证据，目前尚无抗原检测试剂通过国家药监局审批应用于临床。
四大洋七大洲女儿表达父爱的说说《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》将抗体检测纳入新冠肺炎的确诊依据。IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体［呦，新型冠状病毒特异性0M抗体在发病后3~5天开始出现阳性, OM升高指示新近感染，可用于早期诊断,IgG抗体检测可以确认患者的感染状况。血清IgM/IgG抗体检测用于
发热患者的初筛可提高疑似病例确诊率［2）］。此外，通过检测IgM/IgG开展无症状人大规模筛查有利于早期感染患者的检出，可作为核酸检测的互补。相对于核酸检测，血液中的病毒含量相对来说比较低［20］，可降低被感染的风险，对医护人员更加安全。同时，抗体检测和荧光定量RT-PCR核酸检测的联合有助于提高检测的灵敏度，降低误诊率或漏诊率。
胶体金免疫层析检测方法无需依托仪器，操作简单方便，快速直观判定结果，仅需17-30min，可实现POCT，同时每个患者使用一份试纸条，可有效 避免交叉污染。已有研究结果显示，血清OM和IgG抗体的敏感度分别为70.24%和96.10%⑷］, IgM和IgG联合检测可弥补新型冠状病毒肺炎核酸检测的假阴性，特别是OM抗体阳性对核酸阴性疑似COVIDA7患者的确诊有重要价值［（］。
研究表明，化学发光法检测可采用全自动流水线设备进行，时间短、通量高，最快检测速度可达每小时440人份，成本相对较低，并可以对患者的抗体水平进行定量。我国目前应急批准了万孚生物的胶体金免疫层析技术的新型冠状病毒抗体快速检测试剂、英诺特的2219-新型冠状病毒IgM/IgG联合检测胶体金试剂、诺唯赞医疗科技的新型冠状病毒OM /IgG抗体胶体金检测试剂盒和丽珠试剂的新型冠状病毒IgM/IgG抗体胶体金检测试剂盒，以及重庆医科大学牵头联合博奥赛斯生物科技有限公司研发的基于磁微粒化学发光法的新型冠状病毒OM和IgG抗体两个检测试剂盒，共计六种新型冠状病毒抗体检测试剂。
综上，尽管常规认为免疫检测的敏感性和特异性低于核酸检测，但免疫检测技术在新发传染病突发公共卫生事件应急处置过程中弥补了核酸检测手段的不足。
2.0样本的采集及处理按照诊疗指南采用RT-PCR或（和）NGS方法在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。新加坡国家传染病中心对3例确诊患者实时RTACR检测在粪便（50%）和血液（3%）中可检测到病毒，但在尿液中未检测到［2］。我国学者在同一杂志上发表的基于205名确诊患者的1672份样本论文表明痰液（69%）、鼻拭子（63%）、咽拭子（32%）、肺泡灌洗液（93%）、粪便（29%）、支气管活检样本（46%）、血液（1%）中可检出SARS-FoV-9病毒，而尿液中均为检出⑷］。虽然鼻拭子和支气管活检样本的样本数较少，但仍可以看出下呼吸道标本，如痰液的检出率更高，但COVIDA7患者多干咳，痰少。患者不同部位病毒拷贝数不尽相同，对检测结果存在较大的影响，临床上多以上呼吸道样本代替下呼吸道样本，可能出现假阴性如前述普遍使用的咽拭子检测率仅32%，特别是恢复期患者的咽拭子病毒载量偏低［-。此外，采样手法难以标准化也可能导致检测结果偏差，基于临床采集样本的质量是决定检测结果的最主要因素,2月4日，中华医学会检验医学分会针对这一问题在其网络上发布了标准咽拭子采样教程。
英雄杀商鞅怎么玩新型冠状病毒是单链RNA病毒，对保存条件和环境要求高，运输储存不当极易导致降解，采样管及保存液选择不当也易导致核酸检测结果假阴性［14］O 同时，新型冠状病毒对紫外线、热、部分消毒剂敏感，如50°C（30mit）、75%乙醇、乙醚、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病
毒。而新型冠状病毒疫情突袭给定点救治医院的检验科带来了生物安全风险管理和院内感染控制双重挑战［］］，中华医学会的《2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识》提出核酸检测前可66-65C 孵育22-30min，或者使用核酸提取裂解液进行灭活［切。中山大学陈培松等比较了2例样本未经灭活处理、经50C30mU灭活、75%乙醇灭活的核酸检测结果,Ct值无明显差别［（。但浙江大学段秀芝等对比了50C30min水浴、56C60mU干浴、60C30min干浴3种灭活鼻咽拭子方式对新型冠状病毒核酸检测的影响，病毒在高浓度时，灭活与否以及不同的灭活处理对2219新型冠状病毒的阳性检出率影响不大，但当标本病毒在低浓度时，灭活对造成病毒RNA的降解，影响检出率［）］。因此，样本
的种类、采集、保存、运输和前处理对检验结果均存在一定的影响。
3结语
实验室检测在病例确诊和密切接触者排查中都起到了至关重要的作用。尽管目前已审批了基于核酸荧光定量PCR检测方法和胶体金及化学发光
技术的抗体检测法的检测试剂，但综合评估不同检测手段的灵敏度和特异性，以及受病原变异、样本采 集和操作方法等因素的影响同样重要。目前研究表明样本采集部位选择不同、采样量不足、采样后样本保存不当、病程早期病毒分泌量少及检测试剂盒灵敏度不高均可导致假阴性结果。国际疫情形势
严峻，为防止输入病例在国内的传播，可将检测关口前移，密切排查。病毒核酸是最先可检测到的标志物，因此核酸检测对于患者的早诊断、早和疫情的防控具有重要意义。而特异性抗体检测可弥补核酸检测实验条件生物安全标准高的缺陷，实现快速、大规模批量操作，降低医务人员在呼吸道样本采集过程中的暴露风险。在有条件的情况下采取抗体检测和核酸检测并行的检测手段控制检测结果的假阳性及假阴性。随着更多检测手段的成熟，如细胞 因子检测、免疫细胞亚检测等血液学检测可作为辅助诊断方法。各项技术的不断创新、优化和联合也将为C ovia-19患者的诊断和实验室检测提供帮助。
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