• 120 •国际病毒学杂志 2021 年 4 月第 28 卷第 2 期International Journal of Virology，April 2021，Vol. 28, No. 2
•基础研究•
猫MHC I类分子呈递的SARS-CoV-2来源
多肽筛选及其复合物晶体制备
乔佩雯^岳灿2霍恕婷3刘科芳4李敏1郭雅欣1高国兰2刘军1武桂珍1
’中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京102206; 2中国科学院大学存济医
学院，北京100049; 3温州医科大学生命科学学院325035; 4中国科学院微生物研究
所病原微生物与免疫学重点实验室，北京100101
通信作者：武桂珍，Email:wugz@ivdc.chinacdc
【摘要】目的针对猫对新型冠状病毒（SARS-CoV-2)的高度易感性，筛选猫主要组织相容
性复合物丨类（major histocompatibility complex class 丨，MHC 丨）分子FLA-K*00701 呈递SARS-CoV-2
来源的多肽，并探索复合物制备方法，为研究猫感染SARS-C〇V-2的T细胞免疫特征打下基础。方
法对可能与FLA-K*00701具有亲和力的SARS-C〇V-2来源多肽进行预测并合成。采用稀释复性
法，使猫白细胞抗原（feline leukocyte antigen, F L A)I类多肽复合物在体外合适环境下复性，纯化
复合物后，用坐滴蒸汽扩散技术筛选晶体的生长条件，X射线衍射区分收集的蛋白结晶是否为晶
体。结果成功筛选到一条与FLA_K*00701具有高度结合能力的SARS-C〇V-2来源多肽，并得到高
纯度FLA-K*00701蛋白，初步筛选得到FLA多肽复合物晶体，X射线衍射分辨率为2.7A。结论首
次在SARS-C〇V-2易感动物猫中筛选到与其FLA I具有高度亲和力的多肽，并得到高分辨率的复合物
蛋白晶体，本研究为进一步探索猫抵抗SARS-C〇V-2的细胞免疫机制及SARS-C〇V-2多肽疫苗的研
发提供有价值的参考。
【关键词】SARS-CoV-2；猫；MHC丨；易感动物；蛋白纯化
基金项目：国家科技重大专项高级别生物安全实验室和重要病原实验室生物安全保障技术研究
(2018ZX10734-401 )；国家重点研发计划2019-nC〇V溯源和传播途径研究（2020YFC0840800)；国
家自然科学基金（81971501 )
DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2021.02.008
Screening SARS-CoV-2 derived peptides presented by feline MHC I molecules and preparing crystals
of the complex
QiaoPeiwen1, YueCan2, HuoShuting, LiuKefang, Li Min', Guo Yaxin1, GaoGuolan2, LiuJun', WuGuizhen
'National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and
Prevention, Beijing 102206, China; 2Savaid Medical School, University o f Chinese Academy o f Sciences,
Beijing 100049, China; 3School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University,
Wenzhou 325035, China; 4CAS Key Laboratory o f Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of
Microbiology, Chinese Academy o f S ciences, Beijing 100101, China
Corresponding author: WuGuizhen,Email:******************,Tel: 0086-10-58900656
【Abstract 】Objective Based on high susceptibility of cat to severe acute respiratory syndrome
coronavirus 2 (SARS-CoV-2), to screen the peptides derived from SARS-CoV-2 and presented by feline
major histocompatibility complex class I (MHC I) molecule, FLA-K*00701. And to explore the preparation
method of the complex, so as to lay a foundation for the study of T cell immune characteristics of cats
infected with SARS-CoV-2. Methods The peptides derived from SARS-CoV-2 with potential affinity to
FLA-K*00701 were predicted and synthesized. The feline leukocyte antigen (FLA) class I polypeptide
complex was renatured in a suitable environment in vitro by the gradual dilution method. After the
complex was purified, the crystal growth conditions were screened using the sitting-drop vapor diffusion
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technique. X-ray diffraction was used to distinguish the quality of collected protein crystal. Results A
SARS-CoV-2-derived peptide with high binding ability to FLA-K*00701 was successfully screened out,
and a FLA-K*00701 protein with high purity was obtained. The crystal of FLA polypeptide complex was
obtained by preliminary screening，and the X-ray diffraction resolution was 2.7人.Conclusions This is the
first report of isolating polypeptide with high affinity to FLA I from cat which was susceptible to SARS-
CoV-2, and obtaining crystal of the complex with high resolution. The study provided a valuable reference
for further research on the cellular immune mechanism of cat against SARS-CoV-2 and for SARS-CoV-2
peptide vaccine development.
【Key words 】SARS-CoV-2; Feline; MHC I; Susceptible animal; Protein purification
Fund program s: Research on Biosafety Assurance Technology for High-level Biosafety
Laboratories and Important Pathogen Laboratories, National Science and Technology Major Projects
During the 13th Five-Year Plan (2018ZX10734-401); Research on Traceability and Transmission Route
of 2019-nCoV, the National Key Research and Development Program (2020YFC0840800); The National
Natural Science Foundation of China (81971501)
DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2021.02.008
新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒（S A R S- C o V-2)感染引起的呼吸道传染病。目前全球报告 病例数仍持续上升，截至2021年3月3日，全球 累计报告确诊病例已过亿，累计报告死亡病例已 达250万例In，给全球的政治经济造成了不可估量 的影响。有证据显示，武汉疫情暴发期间，猫的 S A R S-C〇V-2中和抗体为阳性，这提示猫感染了 S A R S-C o V-2121。进一步的研究发现，该病毒易在 猫体内复制并可排毒感染其他猫，据此可推断猫 是S A R S-C〇V-2的易感动物，并可能为该病毒的 中间宿主之一 |31。从确诊感染的猫拭子样本中获得 S A R S-C o V-2的全基因组序列，经过序列比对该毒 株与宠物主人或同期该地区人类样本中的优势株 相同，证实了该病毒存在人猫间传播的可能性|41。通过流行病学调查发现，感染的猫中有80%为无 症状感染或只出现打喷嚏症状|51。宿主体内的抗病 毒免疫反应会影响疾病的严重程度和临床转归+71。因此研究猫体内S A R S-C〇V-2的感染与
免疫过程，为进一步了解宿主与病毒作用机制，对S A R S- C o V-2的防控具有重要意义。
T细胞免疫在病毒清除过程中发挥了重要作用+91。而T细胞免疫的核心是细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility (i m p l e x,M H C)分子结合抗原多肽呈递给T淋 巴细胞上的T C R受体，激活T细胞介导的免疫反应|K>1。有研究表明猫感染致死性猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus,F1P V)时，F I P V阳性细胞表面未见病毒抗原表达，但所 有F I P V阳性细胞均表达M H C I类分子M11。宿主 细胞内缺少M H C I类分子表达可以使病毒感染的 细胞躲避细胞介导的免疫反应|l21。M H C I分子由重链（H链）和队微球蛋白（p2m)构成。重链 的胞外区可分为ot l、a2和a3三个结构域。
a l和a2结构域共同构成抗原肽结合槽（peptide binding groove,P B G)丨13|〇P B G 是 M H C I 分子的重要功能区，可以限制性地结合具有特定锚定残 基的基序。然而，猫的M H C I分子（即猫白细胞 抗原F L A I)呈递S A R S-C o V-2抗原肽未见报道，而P B G区结合S A R S-C〇V-2抗原肽的结构基础仍未可知，因此本研究旨在筛选猫M H C I类分子 结合的S A R S-C〇V-2多肽，并通过猫M H C丨类分 子F L A-K*00701与S A R S-C o V-2来源多肽的体外复性、纯化、晶体筛选等过程，旨在获得分辨 率良好的F L A-K*00701复合物晶体，并期望通过 解析晶体结构进一步阐释猫感染S A R S-C o V-2后 F L A-K*00701结合并提呈抗原肽进而激活T细胞 反应的免疫机制。
1材料与方法
1.1猫F L A-K*00701和|32m基因构建
从N C B I数据库检索到基因分型为F L A-K*00701 的胞外区重链（G e n e B a n k:A C K99134.1 )和 F L A- P2m链（G e n e B a n k:A Y829266.1 )。根据大肠杆菌 的密码子偏好性，把目的基因经5’N d e I和3_X h〇I 双重酶切。A C K99134.1克隆至载体PE T-21a (+ ) (Ampicillin)，A Y829266.1 克隆至载体P E T30a (K a n a m y c i n)，构建质粒 p E T-21a-F L A-K*00701 和 P E T-30a-F L A-p2m (Suzhou;G E N E W I Z) 〇
1.2猫F L A-K*00701蛋白的表达及与S A R S-
C o V-2多肽复合物复性和纯化
1.2.1F L A-K*0070丨和F L A-p2m蛋白表达 将p E T-21a-F L A-K*00701 和 P E T-30a-F L A-P2m两 种质粒分别转化到大肠杆菌B L21 (D E3)中，各
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取50 n L涂在对应抗性的L B平板上，挑取单克隆 菌落在5 m L无抗液体L B培养基，37尤的环境下 活化，之后在对应抗性的L B培养基中扩大培养。用紫外分光光度计检测菌液0D值，当其0D值达 到0.4~
0.6时，加人异丙基-p-D-硫代半乳糖苷
(I P T G)诱导剂，诱导蛋白表达。3〜5 h后，收 集菌液，并留样2〇n L用15%S D S-P A G E鉴定是 否表达目的蛋白。其他菌液用超声破碎仪破碎，12 000 r/m i n离心，留取20吣上清液用15% S D S- P A G E鉴定是否表达目的蛋白。将沉淀（主要成 分为目的蛋白包涵体）用洗涤液（5〇111\11>18- H C1,p H 8.0；0.5% TritonX-100；l O m M E D T A, p H8.0; 300 m M N a C l)洗涤三次，再用重悬液（50 m M Tris-H C l；100 m M N a C I;10 m M E D T A)把 沉淀重悬并留样20 n L用15% S D S-P A G E鉴定，最后用溶解液（6M G u a-H C l;100 m M N a C l; 10% Glycerine;50 m M Tris-H C l,p H 8.0; 10 m M
E D T A)溶解目的蛋白包涵体，使浓度最终为30 m g/m L0
1.2.2SARS-CoV-2 刺突蛋白与FLA-K*00701 有 亲和力多肽的预测和合成从SARS-C〇V-2 (G e n e B a n k:N C—〇45512.2)刺突蛋白上选取符合FLA-K*00701结合基序的三条肽YSTGSNVFQ、RSF1EDLLF、FVSNGTHWF (表 1 )。用反相高效 液相谱和质谱法（中国北京亚光生物科技）合 成并纯化多肽，纯度>95%，冷冻干燥后每管分 装2 mg，在-80^下储存，使用前用二甲基亚砜 (DM S0)溶解。
1.2.3 猫 F L A-K*00701 与S A R S-C o V-2 多肽复合
物体外复性使用稀释复性的方法，让蛋白质
在复性缓冲液（100 m M Tris-H C l,p H 8.0，2 m M
E D T A、400 m M L(+)-精氨酸，0.5 m M氧化型谷胱 甘肽和5 m M还原型谷胱甘肽）中打开包涵体的 折叠，缓慢折叠成蛋白天然结构。取0.5 m L
F L A- P2m包涵体在4 的环境中逐滴缓慢注入200 m L
复性缓冲液中，匀速搅拌。待滴完p2m20 m i n后，按照5 m g/L的终浓度加人用D M S0溶解的多肽，继续匀速搅拌2〇m i n。然后加入1.5m L的F L A重 链包涵体（卩仰与重链的比例为1:3)，仍使其 逐滴缓慢滴下，8~10h后用10k D的超滤浓缩杯 将F L A-K*0〇7〇l/多肽复合物浓缩至20 m L左右，再用蛋白质缓冲液（20 m M Tris-H C l,p H 8.0; 50 m M NaCl)按1:10稀释并浓缩换液两次，最终用 蛋白缓冲液置换出复性液组分。使蛋白稳定存在 于蛋白质缓冲液环境中，制备成F L A-K*00701复 合物蛋白溶液。
1.2.4 FLA-K*00701 与SA R S-C oV-2 多肽复合物
纯化用 Superdex™200 Increate10/300 GL 柱 (G E Healthcare，北京），根据体积排阻层析法的原理，使用水相洗脱液基于不同蛋白质的尺寸大小分离纯化F L A-多肽复合物。经计算猫 F L A-K*00701
重链的蛋白分子量为31.44 k D，p2m 的蛋白分子量为l l.47k D，复合物分子量为44 kD〇通过与 Superdex™200Increate10/300 GL 柱标 准品的出峰位置推测目的蛋白的出峰位置为15.25 m L左右，在出峰位置收集蛋白。
1-2.5结晶和数据采集采用坐滴气相扩散技
术，使用 Crystal Screen I/II试剂盒、Index Screen试 剂盒和 P E G R x1"丨试剂盒（All Hampton Research, Aliso Viejo,C A)及 Molecular Dimensions系列试 剂盒筛选F L A/多肽复合物晶体生长条件。
把纯化的FLA多肽复合物蛋白浓缩到1〇 m g/m L 及15 m g/mL后，取1叫蛋白样品和1从筛选试剂，以1:1混匀并密封。并在4 1和18丈的稳定环 境中保存。当观察到有形态较好的单晶时，用专 用金属或尼龙环借助液体表面张力将晶体捞出，在含20%甘油的低温保护剂中浸泡数秒后，快速 冻存在液氮中。在上海同步辐射光源用X射线衍 射的方法采集FLA/多肽复合物高分辨率晶体的衍 射数据。
2 结果
2.1猫F L A蛋白重链和p2m的表达
将收取的细菌破碎菌液后，离心所得上清液中，
重悬起的包涵体进行S D S-P A G E电泳分析。结果 显示：猫p2m在接近丨1k D左右有明显蛋白条带（图1A)，猫FLA蛋白重链在30kD左右有明显蛋白 条带（图1B)。目的蛋白可以在原核系统中以包 涵体的形式表达，表达量和蛋白纯度均较高。
注：M: Marker; 1：全菌；2：全菌破碎后上清液；3：纯化后的包
涵体
图1猫FLA-K*00701蛋白表达SDS-PAGE电泳分析
A：猫P2m蛋白表达电泳鉴定；B: FLA-K*00701重链蛋
白表达电泳鉴
定
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1000
无肽
聚合物
)
5
p2m
y .
. v
10
15
20
洗脱体积(mL)
无肽
FVSNGTHWF
聚合物
罗志祥多人运动图片P1 P2 P3
65KD 45KD 11.5KD
无肽
R SFIED LL^ FLA/RSF-9复合物
5
10 15 20
洗脱体积(mL)
Mr M
2 3
:，
m
3525
31.44 K D
张晓龙陈思斯结婚照15
10 15 20 25洗脱体积(mL)
Q
11.47 KD
注：1: IM 重链二聚体蛋白；2: P2FLA-K*00701/RSF-9复合物蛋白；3: P 3猫P2m 蛋白
宋茜在韩国的人气图2 SARS_CoV-2刺突蛋白来源多肽与FLA-K*00701及p2m 体外复性及复合物蛋白纯化结果A: FLA-K*00701与YST-9
复性的分子筛纯化图；B: FLA-K*00701与RSF-9复性的分子筛纯化图；C: FLA-K*00701与FVS-9复性的分子筛纯化图；
D ：图B 出峰位置SDS-PAG
E 电泳图
2.2 S A R S -C o V -2 中结合猫 F L A -K *00701 多肽筛选及其复合物蛋白纯化
合成S A R S -C 〇V -2的主要免疫原刺突蛋白上与 猫F L A -K *00701具有潜在结合能力的多肽，使用
稀释复性法验证其结合力，获得的F L A -K *00701 复合物用 Superdex ™ 200 Increate 10/300 G L 柱分离， 得到蛋白分子筛纯化图（图2A 、B 、C )。通过与 Superdex1M 200 Increate 10/300 G L 柱标准品的出峰 位置比较，推测出峰1 (P 1 )分子量大小为65 k D 左右，为重链形成的二聚体；峰2 (P 2)分子量大 小为45k D 左右，为目的蛋白F L A -K *00701/多肽 复合物；峰3 (P 3)分子量大小为11 k D 左右，为 F L A -p 2m 。结果显示：3条S A R S -C o V -2来源多肽中，
F L A -K *00701重链和F L A -P 2m 与多肽R S F -9具有
较强的结合能力，而与Y S T -9和F V S -9没有结合 能力（表1 )。同时对与多肽R S F -9结合的复合物 在出峰位置处的蛋白进行S D S -P A G E 鉴定，在15.2
m L 时收集到成分均一稳定的F L A -K *00701/R S F -9
复合物蛋白（图2B 、D )。
表1 SARS-C 〇V -2刺突蛋白多肽信息
多肽名称
多肽序列
蛋白来源
位置
复性情况
YST-9YSTGSNVFQ S 636-644-RSF-9RSFIEDLLF S
815-823+FVS-9
FVSNGTHWF
s
1 095-1 103
-
注：能辅助FLA-K*00701 *链和f t r n 轻链正确复性的标记为“+”，否则
韩庚和刘宪华是一个组合吗标记为
2.3 猫F L A I 与S A R S -C o V -2刺突蛋白多肽
R S F -9复合物晶体的生长情况
在使用蛋白结晶试剂盒初筛时，第5d 观察 到F L A -K *00701多肽复合物晶体在18 t 使用
M D 1-106丨1试剂盒沉淀剂为25%w/v S 0K A L A N
P A 25 C L ，蛋白浓度为10 m g /m L 条件下生长出
如海胆样簇状晶体（图3A )。继续优化蛋白生 长条件，改变沉淀剂浓度为24%w/v S O K A L A N
P A 25 C L ，并取1.5卟蛋白样品和1.5卟缓冲液，
以1: 1比例混合均匀，得到单一片状晶体（图 3B )。在上海同步辐射光源（上海）用X 射线衍 射的方法采集到衍射图样（图3D )。并收集到 分辨率为2.7A 的衍射数据。
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图3采用坐滴气相扩散技术得到的FLA-K*00701与 SARS-CoV-2多肽复合物晶体及晶体X衍射衍射图A：用 晶体试剂盒初筛得到的晶体；B：改变沉淀剂浓度后获得 的晶体；C：晶体衍射前拍摄照片；D：晶体X射线衍射图
3讨论
M H C1类分子是一种多态性糖蛋白，在所有 有核细胞表面均可表达，其P B G区可以限制性结 合8~11个氨基酸的抗原肽，并最终呈递给T细 胞受体，从而激活T细胞介导的免疫反应||41。M H C I类分子的结构特点决定其功能，因此解析 蛋白质结构可以从根本上了解M H C I类分子的抗 原呈递特征。随着X射线衍射技术的发展，越来 越多的生物大分子高级结构得到解析，使大家能 清楚直观看到生物大分子的结构基础，也能更清 楚地了解其生物学功能|151。猫的经典M H C I类 基因为F L A-E、
F L A-H和F L A-K1161。有研究表明F L A-E*01801复合物的A 口袋在P B G中对亲 和力多肽的结合有重要的限制性作用|171。本文详 细介绍了F L A-K*00701 与源于S A R S-C〇V-2 的 免疫优势表位R S F I E D L L F在体外复性结合、结 晶及进行X射线衍射的方法，并得到高分辨率的 F L A-K*00701复合物晶体。通过解析复合物的晶 体结构可以补充另一种F L A-K经典猫M H C I类分 子的结构特点。由于M H C I的高度多态性，本文 所解析的晶体结构仅能阐释猫M H C I类分子等位 基因F L A-K*00701的特征。但是不同型别M H C I 类分子也会有相同的锚定基序，因此可能呈递相 同的多肽|181。因此，本文所筛选的肽也可能被其 他分型的猫M H C I类分子结合并呈递给T C R，这仍有待于进一步的研究。
S A R S-C〇V-2有广泛的宿主，不仅可以感染 人，也可以感染猫、狗、水貂、老虎等动物|M)|。
它在适应每一个新宿主时可能形成新的基因组序
列变异体。S A R S-C〇V-2的刺突蛋白和不同物种
的A C E2蛋白之间的结合亲和力有显著差异，其中
人和猫的A C E2蛋白远比狗、雪貂、小鼠和大鼠更
接近l M|。冠状病毒在宿主体内发生重组产生新毒
株的情况时有发生|211。而猫作为与人类密切接触
的伴侣动物，在自然条件下不仅可以感染S A R S-
神兽开学的幽默说说C〇V-2，也可以感染猫肠道冠状病毒（F E C V)。
因此，需要防止S A R S-C〇V-2和F E C V两种冠状
病毒在猫体内发生重组产生新的毒株。
研究猫M H C I类分子对冠状病毒源多肽的呈
递特征，既可以探索猫抵抗S A R S-C〇V-2病毒感
染的免疫机制，也可以为研发不同物种间S A R S-
C〇V-2通用多肽疫苗提供有价值的参考|221。同时，
猫作为S A R S-C〇V-2的易感动物，是重要的实
验动物感染模型，本研究也为在猫等动物中研究
S A R S-C〇V-2的T细胞免疫和疫苗研发提供了重
要的技术借鉴。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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