基础医学与临床Basic & Clinical Medicine
December 2020Vol.40 No.12
2020年 12月 第40卷第12期
文章编号：1001-6325 ( 2020 ) 12-1645-06
研究论文
新型冠状病毒S 蛋白RBD 的
糖基化及其长度对蛋白疫苗免疫原性的影响
张婷，王志荣，许雪梅*
*收稿日期:2020- 09-18 修回日期：2020-10- 23
基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2020-I2M-2-014 ；2016-I2M-3-026)
*
通信作者(corresponding author ) :xuemeixu@ vip.sina ； xuemeixu @ ibms .pumc.edu
(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物物理及结构生物学系，北京100005)
摘要：目的分析去糖基化及片段长度对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(RBD )三聚体蛋白免疫原
性的影响。方法以SARS-CoV-2 S 蛋白的RBD 为基础，分别突变敲除长度为220个氨基酸的RBD(aa. 331-550)中 的3个N-糖基化残基(N331、N343、N360)，并分别在C 端融合三聚化结构域，利用杆状病毒-昆虫细胞表达3个去
糖基化的三聚体蛋白(RBDT-N1、RBDT-N2、RBDT-N3)；同时构建表达2种糖基化位点不变的三聚体蛋白，即去糖 基化蛋白的野生型对照RBDT 和长度为273个氨基酸的RBDST(aa. 319-591)° Western blot 比较蛋白表达水平，亲
和层析纯化后免疫小鼠，分析血清中RBD 特异性IgG 及SARS-CoV-2假病毒中和抗体水平。结果RBDT-N1、
RBDT-N2及RBDT-N3的表达水平均较RBDT 显著提高,3种去糖基化蛋白诱发的特异性IgG 及假病毒中和抗体水
平均与RBDT 的相当；RBDST 诱发的特异性IgG 抗体及假病毒中和抗体滴度较RBDT 的显著提高(P <0.05, P <
0. 01)°结论 去除RBD 的N-糖基化残基及适当延长RBD 旁侧序列有利于提高RBD 蛋白疫苗的表达水平及免疫
原性，研究结果为以RBD 为基础的SARS-CoV-2疫苗的研发策略提供了参考。
关键词：新型冠状病毒；受体结合结构域；糖基化
中图分类号:R392
文献标志码:A
Impact of glycosylation and length of RBD of
SARS-CoV-2 S protein on the immunogenicity of RBD protein vaccines
ZHANG Ting, WANG Zhi-rong, XU Xue-mei *
(Department of Biophysics and Structural Biology , Institute of Basic Medical Sciences CAMS ,
School of Basic Medicine PLMC , Beijing 100005, China)
Abstract : Objective To analyze the impact of deglycosylation and length of RBD of SARS-CoV-2 S protein on the
immunogenicity. Methods Based on the RBD of the SARS-CoV-2 S protein, three N-glycosylated residues
(N331, N343, N360) in the 220 amino acid RBD ( aa. 331-550) were respectively mutated , and trimerization domains were fused at the C-terminus of resulted peptides. The resulted deglycosylated trimer proteins ( RBDT-N1,
RBDT-N2, RBDT-N3) were expressed in baculovirus-insect cell expression system. The wild-type control of degly cosylated proteins ( RBDT ) and RBDST ( aa. 319-591) with a length of 273 amino acids were also constructed.
The expression levels were analyzed by Western blot. Proteins were purified by affinity chromatography. Mice were immunized, and the sera were subjected to analysis of RBD-specific IgG and neutralizing antibodies against SARS- CoV-2 pseudovirus. Results Deglycosylation increased the expression level of RBD trimers in insect cells. RBDT
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and three deglycosylated proteins(RBDT-N1，RBDT-N2，RBDT-N3)induced similar level of RBD-specific IgG and SARS-CoV-2pseudovirus neutralization titers.ABDST induced high titers of RBD-specific IgG and neutralizing antibodies,which were both significantly higher than that induced by RBDT(P<0.05,P<0.01).Conclusions The results suggest that removing the N-glycosylation residues of RBD and extending the RBD flanking sequence are beneficial to increase the expression and immunogenicity of the RBD protein vaccine.The research provides a useful reference for the development strategy of RBD-based SARS-CoV-2vaccines.
杨二车娜姆微博Key words:SARS-CoV-2；receptor binding domain；glycosylation
鉴于目前尚无新型冠状病毒（severe acute respiratory coronavirus2，SARS-CoV-2）特效药物，疫苗是控制SARS-CoV-2大流行的关键措施。目前已有多种不同形式的疫苗进入临床试验［1］，包括灭活疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗及蛋白疫苗，其中蛋白疫苗诱发产生的中和抗体水平较高［2］。迄今上市的采用非传统技术生产的疫苗均为蛋白疫苗，如乙肝病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗、HPV VLP疫苗、带状疱疹病毒糖蛋白疫苗及流感蛋白疫苗，该类疫苗安全性好，且在诱发中和抗体方面具有优势。
SARS-CoV-2为有包膜的正链RNA病毒，与SARS-CoV及中东呼吸道综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）同属冠状病毒p属，均可诱发急性呼吸系统综合征，其中SARS-CoV-2和SARS-CoV的同源性很高［3］。病毒有4种结构蛋白（S、M、N、E），其中S蛋白是感染入侵的关键蛋白，以三聚体形式分布在包膜表面，其N端含有细胞受体结合域（receptor binding domain,RBD），是冠状病毒疫苗研究的主要靶抗原⑷。RBD与宿主细胞的血管紧张素转化酶2（an-giotensin converting enzyme2,ACE2）结合后,S蛋白发生变构，启动病毒感染入侵［5-6］o SARS-CoV-2的S蛋白高度糖基化，其RBD中至少有4个潜在糖基化位点［7］。目前,SARS-CoV-2的S蛋白糖基化水平对其免疫原性的影响尚不清楚。
SARS-CoV的病毒学及疫苗学研究为SARS-CoV-2疫苗的研发提供了有力的技术支持。首先，研究发现，与SARS-CoV一样，SARS-CoV-2的S蛋白融合前状态的维持也有利于RBD依赖的中和抗体的诱发。目前，进入临床试验的以S全长蛋白为基础的不同形式SARS-CoV-2疫苗均采用可保持融合前状态的S蛋白突变体基因（S-2P）［2,8］，即将aa.986-987置换为2个脯氨酸。其次，SARS-CoV 的研究发现，单独表达RBD片段也可诱发高滴度的中和抗体和保护反应［9-10］，且不受S蛋白融合前状态的限制。与全长S蛋白相比,RBD片段的长度适中，易于改造和在多种不同表达体系进行高水平的表达及纯化。目前分离了多种RBD依赖的中和单抗［11-12］，其识别表位是构象依赖的，表明RBD的中和表位具有一定的空间构象，其旁侧序列对表位构象的维持可能有一定的影响，目前有关不同长度RBD的报道较少。
酵母及CHO细胞表达SARS-CoV的RBD （aa.318-536）蛋白的研究目前已有报道［10，13］，尚未见在昆虫表达体系的报道。昆虫细胞表达体系具有表达量高、易于悬浮培养、操作简单、表达蛋白的糖基化与哺乳动物接近等优点，特别适于真核来源的蛋白表达。本研究采用三聚体蛋白疫苗的形式，利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系，表达获得3种不同的去除N-糖基化残基的SARS-CoV-2RBD（aa.331-550）蛋白及糖基化位点正常的2种不同长度的RBD蛋白。结果显示,N-糖基化的去除可提咼RBD 三聚体蛋白在昆虫细胞中的表达水平，且免疫原性不受影响，长片段的RBD三聚体蛋白的免疫原性比短片段的好。
1材料与方法
l.1材料
293T细胞（本实验室保存）；Huh-7细胞（中国医学科学院基础医学研究所刘力教授惠赠）；草地夜蛾卵巢细胞Sf9、E.coll DH10Bac（Invitrogen公司）；原核表达的RBD蛋白（中国科技大学金腾川教授惠赠）；含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒（本实验室构建）；pcDNA3.1-hS质粒（本实验室构建）；His 标签抗体（OriGene公司）；HisTrapTM HP预装柱（GE
张婷新型冠状病毒S蛋白RBD的糖基化及其长度对蛋白疫苗免疫原性的影响1647
公司）；氢氧化铝凝胶佐剂、MPL佐剂（InvivoGen公司）；雌性Balb/c小鼠30只［斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证号:1103242011001338］。
1.2方法
1. 2.1RBD融合基因重组穿梭质粒Bacmid的构建：在SARS-CoV-2S蛋白序列（GenBank序列号为QHD43416.1）氨基酸319-591位（aa.319-591）或氨基酸331-550位（aa.331-550）的N端融合杆状病毒包膜糖蛋白gp64的信号肽序列（GenBank序列号为AIU56980.1,aa.1-38）,C端融合T4噬菌体三聚化结构域（PDB序列号为1AVY_A,aa.45-71），并在下游进一步融合His标签序列（8个组氨酸），分别获得长片段的RBDST融合蛋白及短片段的RBDT融合蛋白。在RBDT的基础上，删除N331氨基酸，获得RBDT-N1融合蛋白；进行N343S突变，获得RBDT-N2融合蛋白；进行N360A突变，获得RBDT-N3融合蛋白。根据Sf9偏性密码子对上述RBD蛋白的基因序列进行优化，合成获得的RBD 融合基因分别插入pFastBacl载体，转化DH10Bac 感受态,PCR鉴定获得重组Bacmid，提取备用。
1.2.2RBD蛋白的表达及鉴定：将携带RBD融合基因的重组Bacmid转染Sf9细胞，构建重组杆状病毒，感染Sf9细胞后（MOI=0.1）,27T培养约88h，离心收集培养上清。12%SDS-PAGE及Western blot分析培养上清中的RBD蛋白表达情况。一抗为His标签抗体，二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG。
1.2.3RBD蛋白的纯化：表达不同RBD融合蛋白的培养上清在PBS中4V透析24h，经HisTrap1™HP亲
和层析纯化，按GE公司说明书中提供的纯化方案纯化融合蛋白。
1.2.4小鼠免疫：4~6周雌性Balb/c小鼠5只/组,RBD融合蛋白抗原10Rg/剂，联合50Rg/剂的氢氧化铝佐剂及5Rg/剂的MPL佐剂，于第0、3、6周皮下免疫，设PBS免疫小鼠为对照组，于第5、8周尾静脉采集血清。
1.2.5ELISA检测血清中RBD特异性IgG抗体水平：用PBS将原核表达的RBD蛋白稀释至1Rg/mL，包被96孔板（100r L/孔）；使用5% BSA封闭（200r L/孔）；用PBS倍比稀释待测血清，加入96孔板,4V孵育过夜；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG（1:3000）,37V孵育1h；OPD底物显（100r L/孑L）,37V反应5min;2mol/L硫酸（50r L/孔）终止反应；检测九90。九90数值大于0.2且大于阴性对照2倍的最大血清稀释度视为特异性IgG抗体滴度。
1.2.6假病毒的制备：制备方法如文献所述［14］，使用S蛋白表达质粒pcDNA3.1-hS转染293T细胞, 37V培养24h后，用含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒感染细胞（MOI=4）,37V培养48h。收集培养上清，检测假病毒的滴度。
1.2.7假病毒中和实验：如文献所述［14］，使用DMEM完全培养基稀释假病毒，将稀释后的假病毒与倍比稀释的待测血清等体积混合，4V孵育1h，然后加入预先铺好的Huh-7细胞中（2x10"个/100r L/孔,MOI=0.05）。37V孵育24h，使用流式细胞仪检测各孔细胞的感染抑制率。感染抑制率=（1-待测
血清样品中的荧光细胞百分数/阴性对照样品中的荧光细胞百分数）x100%。感染抑制率大于50%的最高稀释倍数即为中和抗体滴度。
欢乐颂安迪的弟弟是谁1.3统计学分析
使用Graphpad软件分析实验数据并作图, ELISA抗体及中和抗体水平以平均滴度（GMT）±SD 表示。
2结果
2.1RBD蛋白的表达鉴定
取等体积（60r L）相同表达条件的各种RBD 蛋白的表达上清进行12%SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,5种RBD蛋白均可在Sf9细胞中分泌表达，其中RBDST的分子质量约40ku（图1，泳道1），其余4种RBD蛋白的分子质量约37ku （图1，泳道2-5），上述5种RBD蛋白的表观分子质量均大于理论值，提示RBD蛋白在昆虫细胞中表达时发生了糖基化。值得注意的是,3种去糖基化的蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3的表达水平均高于RBDT（图1，泳道2-5），提示糖基化的去除可提高RBD蛋白在昆虫细胞中的表达水平。
2.2去糖基化的RBD蛋白免疫血清RBD特异性IgG水平分析
为明确去糖基化对RBD蛋白免疫活性的影响，本研究比较了RBDT与3种去糖基化蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3诱发的RBD特异性IgG
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1.RBDST；
2.RBDT；
3.RBDT-N1；
4.RBDT-N2；
5.RBDT-N3；
图1Western blot分析Sf9表达上清中的RBD蛋白
Fig1Western blot analysis of RBD proteins
小河碧绿碧绿的。好像什么in the culture media of Sf9cells
水平。结果显示,2次免疫后各组的RBD特异性IgG滴度在320~560,3次免疫后各组的特异性IgG 滴度在6400~11200，组间均无统计学差异(图2)°
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图2糖基化不同的RBD蛋白诱发的血清特异性
IgG抗体水平分析
Fig2Analysis of RBD-specific IgG titers induced
by RBD proteins with different glycosylation
patterns(x±s,n=5)
中国银行信用卡申请2.3不同长度的RBD蛋白免疫血清RBD特异性IgG水平分析
为明确片段长度对RBD蛋白免疫活性的影响，本研究比较了较短的RBDT与较长的RBDST诱发的RBD特异性IgG抗体水平。结果显示,2次免疫及3次免疫后,RBDST诱发的特异性IgG滴度分别为880和33280，均显著高于RBDT免疫组(P< 0.05,P<0.01)(图3)°
2.4RBD蛋白免疫血清中和抗体水平分析
本研究采用VSV骨架的SARS-CoV-2假病毒检测各组RBD蛋白3次免疫后的血清中和抗体水平。结果显示,RBDST诱发的中和抗体滴度最高，显著高于RBDT(P<0.01)及3种去糖基化的RBD蛋白
*P<0.05,**P<0.01compared with RBDT group
图3不同长度的RBD蛋白诱发的血清特异性
IgG抗体水平分析
Fig3Analysis of RBD-specific IgG titers induced
by RBD proteins with different length
(x±s,n=5)
(P<0.001)诱发的中和抗体(图4)°
*P<0.01,**P<0.001compared with RBDST group
图4RBD蛋白诱发的SARS-CoV-2假病毒中和
抗体分析
Fig4Analysis of SARS-CoV-2pseudovirus neutralization titers induced by RBD proteins(x±s,n=5)
3讨论
杆状病毒-昆虫细胞表达体系具有表达水平高、安全性好、易于操作等优点。目前利用该体系生产获批上市的疫苗有HPV VLP疫苗、甲状腺癌性蛋白疫苗及赛诺菲巴斯德的四价流感蛋白疫苗。研究发现，Sf9昆虫细胞表达的SARS-CoV RBD蛋白(aa.318-510)诱发的中和抗体滴度显著高于原核表达的[15]°本研究采用昆虫细胞表达体系对RBD (aa.331-550)的不同糖基化敲除突变体及两种不同长度的RBD蛋白进行表达，分析其免疫原性。结果显示，分别去除N331、N343和N360糖基化均可
张婷新型冠状病毒S蛋白RBD的糖基化及其长度对蛋白疫苗免疫原性的影响1649
提高蛋白在昆虫细胞中的表达水平而不影响其免疫原性。SARS-CoV-2RBD(aa.319-545)蛋白糖基化
位点分析的结果[16]显示，N331、N343位点位于RBD受体结合基序结构的基部，即这2个位点不参与结合ACE2。本研究的3个糖基化位点中，N331和N343为典型的糖基化位点基序(NXT/Y)⑺17], N360为尚未确认的潜在糖基化位点。本研究获得的3个去糖基化的突变体免疫原性没有改变，可能是由于这些位点不在与ACE2结合的基序中。但采用SARS-CoV-2假病毒变异株的体外分析显示，N331突变增加了突变株对康复者血清的敏感性[18]，因此N331突变株的抗原性值得深入研究；另外，酵母表达的去糖基化的SARS-CoV RBD蛋白分析[13]显示，去除N331同源的糖基化位点后，其表达水平显著降低，免疫血清的中和抗体水平(假病毒中和抗体水平不变，真病毒中和抗体水平显著提高)有待于进一步分析，而另2个突变体(N343、N360同源位点去糖基化)的表达极低，没有深入研究，这可能是采用的实验评价方法或表达体系不同造成的。本研究还发现,RBD长片段(aa.319-591)的免疫原性较短片段(aa.331-550)的高。结构分析显示，SARS-CoV-2S蛋白的RBD区为aa.319-541区域，其中aa.437-508区域为受体结合基序(receptor binding motif，RBM)。在 SARS-CoV的前期研究中发现，包含RBM的不同长度的RBD片段均可诱发中和抗体，目前SARS-CoV报道的RBD蛋白有2种长度，即193个氨基酸(aa.318-510)[9,13]和219个氨基酸(aa.318-536)[10,13]。最近又报道了两种不同长度的RBD蛋白疫苗，分别是长度为227个氨基酸的SARS-CoV-2RBD(aa.319-545)蛋白疫苗[16]，及长度为223个氨基酸的RBD(aa.319-
参考文献：
[1]Kaur SP,Gupta V.COVID-19vaccine:a comprehensive
status report[J].Virus Res,2020,288:198114.doi:10.
1016/j.virusres.2020.198114.
[2]Keech C,Albert G,Cho I,et al.Phase1-2trial of a
SARS-CoV-2recombinant spike protein nanoparticle
vaccine[J].N Engl J Med,2020.doi：10.1056/NEJ-541)单链二聚体的蛋白疫苗[19]o本课题组目前正在进一步比较这些不同长度RBD蛋白的免疫原性，同时进行去糖基化长片段RBD的研究。
理想的疫苗需同时诱发体液及细胞免疫反应，体液免疫的评价主要检测保护性抗体。康复者血清及S蛋白依赖的中和抗体的被动免疫试验证明，中和抗体在阻断病毒感染中起重要作用[20-22]。目前新冠疫苗研发免疫活性的指标主要是对抗体水平进行分析，因此本研究重点分析三聚体蛋白诱发的特异性IgG及中和抗体水平。结果显示,RBD三聚体诱发的IgG抗体最高可达104，中和抗体水平较IgG 抗体低1个数量级。有文献报道的SARS-CoV-2疫苗的ELISA抗体滴度较高(可达105)，但其与假病毒中和抗体滴度的比值也很高(100：1)[16,19]，有些文献报道的ELISA滴度相对较低，但其与假病毒中和抗体的滴度比值较低(约10:1)[2]，这主要是不同研究采用的试验体系不同造成的，影响因素主要包括假病
毒体系的不同(假病毒的骨架、S蛋白的密度)、分析用细胞系的不同等。因此，目前SARS-CoV-2疫苗的临床研究中经常用康复者血清的中和抗体滴度作为参照。在本研究基础上，本课题组将深入系统地优化RBD蛋白的结构及组成方式，进一步筛选产量高、免疫原性强的蛋白疫苗，届时将全面分析疫苗诱发的细胞免疫、体液免疫及体内保护活性。
总之，本研究发现,SARS-CoV-2RBD去糖基化修饰可提高其在昆虫细胞中的表达水平，同时又不影响其免疫原性；较长片段的RBD蛋白疫苗(aa.319-591)免疫活性优于短片段的RBD蛋白疫苗。研究结果不仅可用于蛋白疫苗的研究，也可用于基于RBD蛋白抗原的病毒载体疫苗及核酸疫苗。
Moa2026920.
[3]Xu J，Zhao S，Teng T，et al.Systematic comparison of
two animal-to-human transmitted human coronaviruses:
SARS-CoV-2and SARS-CoV[J].Viruses,2020,12：
244-260.
[4]Walls AC，Park YJ，Tortorici MA，et al.Structure，func
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