16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：
1.提取细菌基因组 DNA,
2.设计/选择引物进行 PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离
4.胶回收目的片段
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树
试剂：
1.21M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) (1L): 121.1g Tris，加浓盐酸约(70ml,
60ml, 42ml ),高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调 pH,每升高1C, pH大约下降 0.03 个单位。(Tris-HCl 缓冲液(0.05mol/L , 25C) 50ml 0.1mol/L 三羟 甲基氨基甲烷(Tris)溶液与x ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至 100ml。Tris缓冲液 不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂， Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一 )
1.30.5M EDTA (pH8.0) (1L): 186.1g Na2EDTA?2H2O 用 NaOH调 pH 至 8.0
约 20g ),高温高压灭菌，室温保存。(配置方法
1.称取186.1g Na2EDT?2H2O置于1L烧杯中。2.加入约800mL的去离子水， 充分搅拌。3.用NaOH调节pH值值8.0 (约20g NaOH。注意：pH值至8.0 时，EDTA才能 溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5.适量分成小份后， 高温高压灭菌。6.室温保存。)
1.410X TE Buffer (缓冲液)(pH7.4，7.6，8.0) 魔术师yif资料(1L):组分：100 mMTris-HCl ， 10 mM EDTA 1M Tris-HCl ( pH7.4，7.6，8.0 ) 取 100ml，0.5M EDTA(pH8.0) 取20ml。高温高压灭菌，室温保存。
1X TE Buffer 用 10X TE Buffer 稀释 10倍即可。
1.510%SDS (W/V：称10gSDS 68 E加热溶解，用浓盐酸调 pH至7.2。室温 保存。用之前在65E溶解。配置时要戴口罩。
& 5M NaCI:称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4C保存。
7、 CTAB/NaCI(10%CTAJB0.7M NaCl):溶解 4.1g NaCl，加 10g CTAB (十六烷 基三甲基溴化铵)，加热搅拌。用之前在65E溶解。
8、 氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24: 1 (V/V)的比例加入异戊醇。
9、 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl 平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、 TAE缓冲液：使用液 1X： 0.04 mol/L Tris- 乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓 储存液 50X： 242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、 6X上样缓冲液(100 ml): 0.25%溴酚蓝(BPB，40淞糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0) (0.2 ml )，4C保存。
12、 0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、 EB 10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕瓶室温避光保存。EB 的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml琼脂糖凝胶时加入EB中国界首打一地名为2.5ul。(因EB 是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有 Gelred等)
14、 蛋白酶K: 20 mg/ml溶于水，-20 °C保存，反应浓度 周杰伦写的歌50 ug/ml，反应缓冲 液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA,5%SDS 反应温度 37-56 C。 无需预处理。
15、 RNaseA: 10 mg/ml。25 mgRNaseA 力口 1MTris (pH 7.5 ) 25ul，2.5M NaCI 15ul，无菌水2460 ul，于100C加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份 保存于-20 C。(为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA)
1.1细菌基因组dnA提取
基本步骤：
材料准备
破碎细胞或胞膜一内容物释放
、丿
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组dnA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、 紫外/荧光观测仪 细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同
1快速微量提取法
取1.5ml菌体培养物于一灭菌 Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜， 收集菌体。
加入 400ul 裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7-8 混匀,置于37°C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于 13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后， 13000rpm离心15min,弃上清液，沉淀用70%L醇洗2次；置于室温干燥后， 溶于50ulTE溶液中，置4C保存备用。
2蛋白酶/SDS法制备
用10ml含适当抗生素的GBMS夜培养Delftia sp.
4000rpm 离心 10min 收集菌体，用 Washing TE ( 50mmol/LTris-HCI pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体 2 次。
将菌体充分悬浮在5ml 1 x TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、
0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50 T放置3h-5h。
用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽 提一次。(取上清液。
乙醇沉淀DNA
用自动移液器吸管头将絮状 DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%L醇洗2次，干 燥后溶于适
当1XTE或ddHO中。
3
细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37°C摇床(300rpm)培养过液。
细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上 清，沉淀重新悬浮于1ml TE (pH8.0)中(用ddHO也行)。
菌体裂解：加入6卩l 50mg/ml的溶菌酶，37C作用2h十大名牌奶粉。再加2mol/LNaCI50 卩l，10%SDS10y l，20mg/ml的蛋白酶 K 3卩l，50C作用3h或37C过夜。 (此时菌液应为透明粘稠液体)。
抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24 :
1)，混匀，室温放置 5-10min。 12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很 粘稠，吸取时应小心，最好头尖应剪去)。
沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10min。1 2000rpm离心10。 洗涤：沉淀用75%勺乙醇洗涤。
抽(凉)干后，溶于蒋丽莎个人资料50卩l ddH 2O中，取2-5卩l电泳。作PCR模板用。
5 CTAB/NaCl 裂解法
接两环菌(0.75ml甘油管菌液)于25ml LB培养基中，37C、200r/min培 养 24h。
取1.5ml菌液于1.5ml Eppendof 离心管中，8000r/min离心5分钟，弃去 上清。
加入1.5ml TE离心洗涤后，用567 ul TE溶解菌体，混匀。
加入30卩l 10%SDS和3 ul 20 mg/ml 的蛋白酶 K (100 ug/ml )，混匀，于 37 C温育1h。
加入100卩l 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入 80卩l CTAB/NaCl,混匀,65 C
温育10分钟。
加入等体积的氯仿/异戊醇现在出入深圳最新规定(24:1) (0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟，
保留上清。
上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24 : 1)(0.8ml),混 匀,12000r/min 离心5分钟,保留上清。
加入0.6倍的异丙醇(0.48ml ),轻轻混合直到DNA沉淀下来
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