第五章 蛋白质和氨基酸的测定
1.  蛋白质概况
  蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等；
是生物体的重要的结构和功能性物质，也是食品的主要营养物质成分；
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。蛋白质食品是人体对8种必需氨基酸的来源；
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的、香、味；
●
● 蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。
● 在食品和生物材料中包括蛋白质，还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮的素），蛋白质测定时需要尽可能加以鉴别；
● 由于氨基酸组成不同，不同蛋白质含氮量也不同，一般样品中由于蛋白质种类繁多，使总蛋白含氮量稳定在16％左右，即一份氮素相当于6.25份蛋白质， 6.25为常用的蛋白质系数；
● 一些特定种类的样品蛋白质系数为花生5.46，大米5.95，大豆5.71，小麦5.70，牛乳6.38
蛋白质的测定原理分两大类：
● 利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；
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● 利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性、碱性基团及芳香基团等测定蛋白质含量。
凯氏定氮法
● 凯氏定氮法是准确性较高的测定方法，常作为标准检验方法；微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器
● 凯氏法改良的主要问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及简化操作的问题
● 经过不断改进，使应用范围、分析准确度、操作速度方面不断优化
蛋白质快速测定法：
双缩脲法、水杨酸法、考马斯亮兰结合法等显比法，
紫外分光光度法，折光法、旋光法等物理分析法
常用于生产中。
氨基酸及测定概况
● 氨基酸是蛋白质的水解产物，天然分离的氨基酸达175种以上，但基本氨基酸只有20种，其中Leu,Ile,Lys,Phe,Met,Thr,Ser,Val八种为必需氨基酸，是食品分析中的重要项目
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● 氨基酸总量——酸碱滴定法，比法
● 各种氨基酸的分离与定量——谱法
第一节 凯氏定氮法测定蛋白总量
● 新鲜食品中的含氮化合物以蛋白质为主要成分，样品中还有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉及含氮素，测出的总氮称为粗蛋白含量
● 凯氏定氮法由Kieldahl于1833年提出，经过不断改进，演变为常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法和改良凯氏法等

一、常量凯氏定氮法
1. 原理
    样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
通过加碱蒸馏，使氨蒸出，依下法滴定
①　用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
凯氏定氮法整个过程分三步：
● 消化
● 蒸馏
● 吸收与滴定
1）消化过程及其总反应式：
● 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 =(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
● 其中，浓硫酸（98%）具有的脱水性和氧化性，使：
● 有机物脱水后炭化为碳、氢、氮。
● 碳被氧化为CO2，硫酸被还原为SO2
● SO2使N还原为氨，本身被氧化为SO3
消化过程的促进剂——硫酸钾
● 作为增温剂，提高溶液沸点，
● 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。原因在于随着体系体积减小（硫酸分解、水和CO2挥发），使硫酸钾浓度增大，生成的硫酸氢钾增多，使沸点升高，
● 也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
消化过程的催化剂——硫酸铜
加硫酸铜作为催化剂
C+2CuSO4 →Cu2SO4↓+ SO2↑ +CO2 ↑
Cu2SO4 +2H2SO4 →2CuSO4 + SO2↑ +2H2O
当C被氧化完， Cu2SO4沉淀不再生成，溶液呈现透明的蓝绿，指示消化终点
还可以做蒸馏时碱性指示剂
其它催化和氧化剂
也可以、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛为催化剂。
加入氧化剂  如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
2）蒸馏过程
在完全消化的样品溶液中加入过量的浓氢氧化钠，加热蒸馏，使氨全部蒸出，用过量硼酸或标准强酸溶液吸收
3）吸收与滴定
用4%硼酸吸收，用0.1M盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）
硼酸的Ka1＝5.8×10－10，酸性很弱，滴定时不影响指示剂的变范围
滴定反应的实质是NH3与HCl的强酸弱碱反应，其滴定终点在酸性范围：pH4.3-6.25
用酸滴定
甲基红 变范围pH4.4～6.2  红-黄pKa＝5.2
溴甲酚绿 变范围pH3.8 ～5.4 黄-蓝pKa＝4.9
混合指示剂变时酸 （红-灰-绿） 碱变点pH5.1（ 1 份： 5份，0.2％乙醇溶液）
用碱滴定
● 用定量过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，滴定终点pH为4.3～9.7
● 以甲基澄（红3.1-4.4黄)、酚酞(无8.0-9.6红)或甲基红作指示剂。
2、操作方法：
1) 消化
准确称取固体样品0.2～2g，小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶，加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml，摇匀，安装消化装置，于凯氏瓶口放一个漏斗，将烧瓶斜置于石棉网上；（问题1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜立即发生什么变化？）
常量凯氏定氮消化、蒸馏装置
改进后的消化装置
2）用小火加热，使内容物炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持液体微沸状态，至液体变为蓝绿澄清，再微沸30分钟；
3）（准备蒸馏）冷却后小心加入200ml蒸馏水，再放冷，加入数个玻璃珠（防止爆沸）。
问题2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？
问题3、瓶颈有什么颜的有毒烟产生？
问题4、如何判断消化的终点？
4）蒸馏：
● 凯氏瓶安装到蒸馏装置中，接受瓶内装入50ml 4％硼酸溶液及混合指示剂2－3滴；从漏斗加入70－80ml40％氢氧化钠溶液，摇动，至溶液变深蓝或产生黑沉淀，再加入100ml蒸馏水，关闭加样口，加热蒸馏，至氨全部蒸出，馏液约我是隔壁的泰山250ml。
问题5、加入过量40％氢氧化钠溶液时溶液颜有什么变化？
● （检查蒸馏终点）将冷凝管下端提起，用洗瓶冲洗冷凝管口，取1分钟后的蒸馏液几滴，用奈氏试剂检查，如无红棕出现，表明氨蒸馏完毕，即可停止加热和蒸馏
● （滴定）将接受瓶中的液体直接用盐酸标准溶液滴定至绿变微红为终点，记录盐酸用量
● 空白实验的操作：从消化开始。。。
问题6、如何检验蒸馏终点？
检查氨是否全部蒸完
以奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕
              检验NH4+离子，遇铵离子析
              出黄或红棕沉淀。
奈氏试剂配制
3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。
3、结果计算：
F——氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25
4、方法说明：
1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。
3）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。
4）样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。
5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。
6）若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。
7）—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝或浅绿，但含铁量多时，呈较深绿。
8）蒸馏装置不能漏气。
9快乐大本营 唐嫣）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
      氢氧化铜在70～90℃时发黑。
10） 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。
11）硼酸吸收液温度不超过40度，过高使氨容易散失
二、微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围
2、与常量法不同点：
采用水蒸汽蒸馏
加入接受瓶的硼酸量由50 ml → 10 ml,
滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L→ 0.01 mol/L可用微量滴定管。
凯氏烧瓶较小100 ml
微量凯氏定氮装置
3 、 微量凯氏定氮法操作过程：
● 消化：消化方法同常量法；消化完全的消化液完全转移到100ml容量瓶定容。
● 蒸馏：用水蒸汽蒸馏方法提取氨：准确取10ml消化稀释液于微量反应管中，经漏斗再加入10 ml 40％氢氧化钠使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，关漏斗，进行水蒸汽蒸馏，冷凝管下端插入10 ml4％硼酸溶液中
● 蒸馏及滴定：蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿时再继续蒸馏10分钟后，将
冷凝管口提起离开液面再蒸馏1 min，用蒸馏水洗管口后停止蒸馏，用0.01M盐酸标准溶液滴定并同时作空白对照
qq邮箱登陆登录4、微量凯氏定氮法说明
1) 水蒸气发生器的水中加入甲基澄及硫酸数滴使保持酸性，避免水中的氨带入样品中
2) 蒸馏过程中保持加热，防止溶液倒流
3) 消化液中碱要加足，使呈强碱性；漏斗采用水密封，以免氨散失
三、自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前
  2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。
（2）快速：催化剂以片剂形式加入，一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。
自动凯氏消化仪
● 同时能消化20个样品。
● 新的加热元件是一个无需维修的铝块加热器。
● 消化管受热均匀，消化过程中蒸发出的蒸汽全被收集。
● 消化温度和消化时间均可输入程序，并能显示。
● 玻璃器件均为硼酸盐玻璃，无金属离子污染样品以确保样品的纯净。
● 仪器价格低，准确度高：在滴定时，采用 PH电极确定滴定终点，其灵敏度要高。
● 操作人员可用随机所带的PH4及PH7两个标准溶液对PH电极的校正就可得知该电极是否还能正常工作。