CCR1在鼻咽癌中的表达及其临床意义
郭俊宇;李泽文
【摘 要】目的 研究趋化因子受体1 (CC chemokine receptor 1,CCR1)在鼻咽癌中的表达及其临床意义.方法 运用免疫组化染法及荧光定量PCR方法检测71例鼻咽癌组织及71例癌旁组织中CCR1的表达水平,分析CCR1表达与鼻咽癌患者临床病理特征之间的关系.结果 免疫组化结果显示,CCR1在鼻咽癌组织中的阳性率为77.5％(55/71),在癌旁组织中的阳性率为21.1％ (15/71),鼻咽癌组织中CCR1表达水平显著高于癌旁组织(P＜0.05);荧光定量PCR检测结果显示,在鼻咽癌组织中CCR1 mRNA的表达水平显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P＜0.05).CCR1的表达与鼻咽癌患者的年龄、性别无显著相关性,而与患者的临床分期、T分期、分化程度、淋巴结转移呈正相关关系.结论 CCR1在鼻咽癌的发生发展中可能起到癌基因的作用,CCR1表达水平可作为判断鼻咽癌临床预后的预测指标.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2015(022)012
【总页数】4页(P1256-1259)
给喜欢的女生表白的话【关键词】山楂树之恋演员CCR1;鼻咽癌;表达;临床意义
【作 者】郭俊宇;李泽文
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【作者单位】湖北省孝感市中心医院耳鼻咽喉科,湖北孝感432100;湖北省孝感市中心医院耳鼻咽喉科,湖北孝感432100
【正文语种】中 文
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国高发的恶性肿瘤之一，其具体病因不明，可能与EB病毒感染、原癌基因激活或抑癌基因失活、环境因素等相关［1］。鼻咽癌具有隐蔽性发生的特点，由于其早期症状不典型、生长部位特殊，极易造成漏诊误诊。大部分鼻咽癌患者因发生颈部淋巴结转移就诊，此时已进入中晚期，放疗效果较差［2］。因此，淋巴结状态是影响无远处转移鼻咽癌患者总生存率的独立预后因素［3］，对鼻咽癌发生远处转移的发病机制研究及寻潜在的新标志物十分迫切和必要。既往研究表明，肿瘤细胞能分泌趋化因子(chemokine)，通过趋化因子受体(chemokine receptor)作
用于间质细胞而产生趋化作用，并在间质细胞的帮助下，完成侵袭过程，转移至血循环或者淋巴系统。因此，趋化因子可以作为肿瘤微环境的重要调节因子，参与上皮细胞癌、鳞癌、间充质细胞癌等肿瘤的形成、侵袭、转移等过程［4］。前期研究并未发现趋化因子受体1(CC chemokine receptor 1，CCR1)与鼻咽癌的发生发展之间的关系。本研究采用免疫组化和荧光定量PCR的方法，分析CCR1在我院71例鼻咽癌组织与癌旁组织之间的表达差异，并探讨CCR1表达在鼻咽癌发生发展的差异及其临床预后意义。
山下智久北川景子材料与方法
1 临床研究对象
选取2011年1月至2015年2月我院耳鼻喉科及肿瘤科患者的鼻咽癌组织标本71例，分别取癌组织71例及正常的癌旁组织(距离癌组织2cm以上，镜下未见病理异常)71例。其中男性患者40例，女性患者31例;临床分期为I～II期27例，III～IV期44例;T1+T2 30例，T3+T4 41例;年龄为25～71岁，中位年龄55岁;无颈部淋巴结转移26例，有颈部淋巴结转移45例;高分化20例，中低分化51例。所有标本取材后，立即分为两个部分，其中一部分置于4%多聚甲醛中固定保存，以进行免疫组化实验;另一部分立即在显微镜下进行组织分离，将其分为癌
马伊琍 微博组织和癌旁组织，冻存于液氮中，以进行后续荧光定量PCR验证CCR1表达情况。
2 免疫组化
2.1 染方法 ① 所收集标本4%多聚甲醛固定后，送病理科进行石蜡包埋、脱水、切片，切片厚度约2.8μm。切片标本置于玻璃载玻片后，烤箱75℃烤片3h，立即置于梯度二甲苯溶液和梯度乙醇溶液中脱蜡，放置待用。②对已脱蜡的病理切片进行HE染和CCR1免疫组化染，免疫组化染之前使用碧云天公司抗原修复液进行修复，后续组化染方法按照组化试剂盒说明书步骤进行(碧云天公司)。CCR1一抗购自Abcam公司，阳性对照采用人造血干细胞，阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗。
2.2 结果判定标准 由两名研究者采取双盲法判定免疫组化结果，在光学显微镜高倍镜下(10×40)观察切片，每个标本切片三张，每张切片随机选择6个视野。CCR1的最终得分以阳性细胞百分率及染强度得分之后进行计算，细胞染强度得分为:无着为0分，弱着(浅黄)为1分，中等着(棕黄)为2分，强着(黄褐)为3分。阳性细胞百分率及得分计算方法:阳性细胞0～5%记为0分，阳性细胞6% ～＜25%记为1分，阳性细胞26% ～50%记为2分，阳性细胞＞50%记为3分。两项得分相加后判定组化结果着强度:0分为阴
性(－)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。
3 荧光定量PCR
3.1 组织RNA提取 ①将液氮冻存的组织块取出，并在液氮中碾磨成粉末，加入 TRIZOL(TAKARA公司)裂解组织，室温放置10min;②按1∶5(:TRIZOL)比例加入萃取RNA，激烈颠倒混匀，使液体浑浊，室温放置15min后，4℃低温离心机12000g离心15min，液体分为三层，吸取上层水相;③按1∶1(上层水相体积:异丙醇体积)比例加入异丙醇沉淀RNA，室温放置10min或者4℃低温过夜，4℃低温离心机12000g离心10min;④ 将离心后上层液体丢弃，可看到白沉淀，加入75%无水乙醇，4℃低温离心机7500g离心5min;⑤ 丢弃上层液体，加入100%无水乙醇，4℃低温离心机7500g离心5min，再次丢弃上层液体，室温静置直到RNA沉淀干燥，吸取DEPC水将RNA溶解下来;⑥ 测定RNA浓度，A260/A280比值皆在 1.8～2.3区间，A230/A280比值均在2.0以上，说明标本提取过程比较标准，所得样品纯度较好。
3.2 荧光定量 PCR验证 RT-PCR采用TAKARA逆转录试剂盒20μL体系，其中RNA模板1μg，PCR buffer 4μL(包含镁离子、dNTPs、甘油等)，Oligo dT引物和随机引物各1μL，
逆转录酶1μL，其余用DEPC水补足，反应条件为:37℃ 15min，85℃5s，4℃保存;荧光定量PCR采用20μL反应体系，模板为 100ng，CCR1 上下游引物各 1μL，TAKARA SYBR GREEN(包含镁离子、DNA染液、dNTPs等)10μL，其余用DEPC水补足;反应条件为:95℃预变性3min，95℃ 30s+57℃ 30s+72℃ 30s共计 39 个循环，72℃ 3min，4℃保存，引物序列为:CCR1上游引物:GGGAAAGGTGGCCAAACACT，下游引物:TGCTCATGGTGGAAGA AGTCC，产物长度:73bp。
4 统计学分析
采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。应用直线相关和回归分析，分析CCR1蛋白表达与患者性别、年龄、临床分期、T分期、分化程度和淋巴结转移的相关性;组间比较采用 χ2检验，当 P＜0.05时，为差异具有统计学意义。
结 果
1 免疫组化检测CCR1在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达差异
在鼻咽癌组织和癌旁组织中，CCR1在细胞核和细胞质中均有表达，切片免疫组化染呈
黄、棕黄、黄褐。但CCR1主要表达于癌组织中(阳性率为77.5%，55/71)，在癌旁组织中少量表达(阳性率为21.1%，15/71)(见图1)。在71例鼻咽癌组织中，CCR1蛋白表达为“－”的5例，“+”为10例，“++”为36例，“+++”为20例。71例癌旁组织中，CCR1蛋白表达为“－”为35例，“+”为25例，“++”8例，“+++”为3例(见表1)。经过统计分析，CCR1在癌组织的表达水平显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
图1 A CCR1在鼻咽癌组织中表达情况;B CCR1在癌旁组织中的表达情况
表1 CCR1在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达分布情况组别 例数CCR1－ + ++ +++ P 值癌组织71 5 10 36 20 0.001癌旁组织71 35 25 8 3
2 荧光定量PCR检测CCR1 m RNA在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达差异
提取71例鼻咽癌组织和71例癌旁组织RNA，荧光定量PCR检测CCR1 mRNA在鼻咽癌组织和癌旁组织的表达情况(见图2)。CCR1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。
图2 荧光定量PCR检测CCR1在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达差异
3 CCR1蛋白表达与患者临床病理特征的关系
经统计学分析，CCR1蛋白表达水平差异与性别、年龄无显著相关性，直线回归关系的相关系数r值接近0，而与临床分期、T分期、分化程度、淋巴结转移呈正相关关系，r值接近于1。表现为CCR1蛋白表达水平越高的患者，其恶性程度越高。(见表2)。
表2 CCR1蛋白表达与患者临床病理特征的关系CCR1蛋白表达临床资料 例数r 值阴性 阳性性别0.025男40 18 22女31 17 14年龄(岁)0.038≥55 38 20 18＜55 33 18 15临床分期0.423 I～II 27 15 12 III～IV 44 11 30 T分期0.445 T1+T2 30 17 13 T3+T4 41 10 31分化程度0.658中、低 51 16 35高20 5 15淋巴结转移0.873无26 17 9有45 14 31
讨 论
肿瘤的发生、侵袭、转移等一系列事件的发生，是由众多癌基因、抑癌基因和环境因素共同作用的复杂过程。肿瘤发生、转移相关基因的过表达以及抑癌基因的低表达全程调控了肿瘤的进程［5-6］。因此，为了降低鼻咽癌较高的发病率及死亡率，探索鼻咽癌背后的分子及病理机制，关于鼻咽癌发生发展过程中的癌基因研究成为国内外研究的热点问题。趋
化因子是细胞因子超家族中的重要成员，是一大类具有化学趋化作用的小分子蛋白质物质，在与趋化因子受体结合后，可以调控免疫应答、胚胎发育、诱导血管形成、肿瘤侵袭转移等过程，在众多生理、病理过程中发挥重要作用［7-8］。在2001年时，Muller等首次提出CCR1在乳腺癌的器官选择性转移中发挥重要调节作用。后来，更多证据表明趋化因子与肿瘤的侵袭和转移密切相关［9］。然而，目前尚未见关于CCR1蛋白在鼻咽癌与癌旁组织中的分布差异情况及其具体作用机制的相关报道。
在本研究中，我们采用免疫组化和荧光定量PCR的方法观察CCR1蛋白在鼻咽癌组织及癌旁组织中的表达差异情况。免疫组化结果提示，CCR1蛋白在鼻咽癌组织和癌旁组织中均有表达，而且在细胞核和细胞质中均有分布。通过对阳性细胞百分率和细胞染强度进行评分，我们发现CCR1蛋白在鼻咽癌组织中高表达，而在癌旁组织中表达水平较低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示CCR1蛋白的表达水平可能和鼻咽癌具有相关性。同时，我们还采用了荧光定量PCR检测CCR1在鼻咽癌组织和癌旁组织中的转录水平差异，结果提示鼻咽癌组织的CCR1转录水平也显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。进一步分析CCR1蛋白表达与患者临床病理特征的关系，我们发现，CCR1蛋白的表达水平与年龄、性别无显著相关性，r值接近0，而与肿瘤的临床分期、T分期、分化程度、淋巴结
转移情况呈正相关关系，r值接近1，表现为CCR1蛋白表达水平越高的患者，其恶性程度越高，预后越差，这与部分研究者的前期研究成果一致。既往研究提示，CCR1蛋白表达与肝癌的侵袭转移，尤其是在肝门静脉浸润过程中，可能起到了关键作用，并与结肠癌的侵袭转移密切相关。我们的研究发现，随着鼻咽癌分期的提高、淋巴结转移的增多，CCR1蛋白表达水平也相应升高，具有正相关关系，提示CCR1可能与鼻咽癌的侵袭、转移过程关系密切，但其影响方式及具体机制尚需大量基础实验的验证。