安立龙, 效 梅, 窦忠英, ( 西北农林科技大学畜牧兽医学院, 陕西杨陵 712100)
文章编号: 100725038 ( 2001) 022*******
中图分类号: S827. 36; Q 954. 432 文献标识码: A E S 细胞。 但从 STO 饲养层培养的内细胞团 ( in n e r
ce ll m a ss I (M ) 细胞中分离的 E S 细胞存活率、
嵌合 力 均 低 于 PM E F , 且 核 型 异 常 的 E S 细 胞 的 比 率 比
PM E F
的高。其原因很可能是 STO 细胞在保存过程
中发生变异, 分化抑制物分泌机能降低1, 2 。 以 STO
小鼠 胎 成 纤 维 细 胞 (m u r i n e f i b ro b la s t , M E F )、大 鼠
肝 条 件 培 养 基 ( b uffa l o R a t live r , BRL ) 和 STO + BRL 为材料克隆猪 E S 细胞, STO 和 STO + BRL 组 最高传代数为 10 代, 而M E F 组传代数仅为 3 代3 。
小鼠囊胚在不同类型饲养层培养, 在 4 d 之内, 内细 胞团分化速度依次为 STO > M E F > 大鼠胎儿成纤
摘 要: 胚胎干细胞是从动物胚胎内细胞团 或原始生殖细胞分离的具有全能性的细胞, 在遗传学、发育生物学和细胞工程领域具有 广阔的应用前景。 抑制胚胎干细胞分化和促 进胚胎 干 细 胞 增 殖 是 克 隆 胚 胎 干 细 胞 的 关 键, 本文介绍了饲养层、条件培养基、分化抑 制因子对哺乳动物胚胎干细胞分离与克隆的 影响, 并探讨了白血病抑制因子影响胚胎干 细胞克隆的机理, 认为在饲养层中添加分化 抑制因子能有效提高胚胎干细胞克隆率。 关键词: 胚胎干细胞; 饲养层; 条件培养基; 细 胞; 克隆
龟梨和也整容尽 管 在 小 鼠 已 成 功 地 分 离 到 胚 胎 干 细 胞
( Em b ryo n ic stem ce ll , E S 细胞) , 获得了 E S 细胞生 殖腺嵌合体动物, 但 在 其 它 动 物 仅 分 离 出 类 E S 细 胞, 尚未完全建立 E S 细胞系, 限制了其应用。研究培 养条件对动物胚胎细胞增殖及 E S 细胞分离与克隆 效率的影响, 是建立完善 E S 细胞培养与克隆体系的 关键环节。阻止细胞分化并促进增殖是建立完善 E S
细胞培养体系的核心。 本文就饲养层及分化抑制物 对 E S 细胞分离与克隆效率影响加以评述。
1 饲养层对 E S 细胞克隆效率的影响
饲 养层是将具有贴附能力的细胞 ( 如成纤维细 胞、子宫上皮细胞、大鼠肝细胞、睾丸成纤维细胞等)
在培养皿中培养, 使其贴壁, 然后用丝裂霉素 C 或紫 外线处理, 阻断有丝分裂, 使贴壁的细胞保持活力, 但不增殖。 饲养层细胞分泌的因子可抑制胚胎细胞 及 E S 细胞分化, 并促进胚胎细胞及 E S 细胞增殖。用 已成系的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层 (STO ) 和小鼠 原 代 胎 儿 成 纤 维 细 胞 ( P r i m a r y m u r i n e em b ry o n i c f i b ra b la s t , PM E F ) 饲养层培养小鼠囊胚, 均可获得
3 维细胞, 而培养在 RU C S 的 I C M 增殖 但 未 分 化 。
羊全胚或分离的 I C M 在 STO 饲养层上不扩展, 而在 同源胎儿成纤维细胞饲养层上能扩展, 但未获得 E S
细胞。从猪全胚分离的 I C M 在BRL 猪上皮成纤维细 胞、猪 H 3A 细胞系和猪子宫上皮细胞等饲养层上均 不附着生长。猪胚胎在 STO 或 STO + BRL 2CM 上附 3
着和增殖, 并可获得 E S 细胞 。小鼠全胚或 I C M 在 STO 饲养层和 M E F 饲养层均附着增殖, 并可 获 得
E S 细胞。 比较 STO 、BRL 、
绵羊输卵管上皮、绵羊子宫上皮、山羊子宫上皮以及牛胎儿睾丸成纤维细胞、 胎牛肾成纤维细胞、胎牛肝成纤维细胞和牛子宫成 纤维细胞等饲养层分离 E S 细胞的效果, 结果只用胎 牛肝成纤维细胞饲养层分离到绵羊和山羊类 E S 细 胞4 。 我们的实验表明, 用小鼠胎儿原代成纤维细胞 作饲养层, 能成功地分离到牛类 E S 细胞。总而言之, 小鼠原代成纤维细胞饲养层可用于大多数动物 E S 细胞的分离。 但是, 不同种类动物胚胎分离 E S 细胞 的最佳饲养层不尽相同, 尚需进行更多的实验。
2 条件培养基对动物 E S 细胞克隆的影响
分离和克隆动物 E S 细胞, 需要条件培养基中含 有能促进细胞增殖并抑制细胞分化的有效成份。 饲 养 层 细 胞 虽 然 能 通 过 细 胞 接 触 机 制 和 非 接 触 机 制 (分泌某种物质) 促进 E S 细胞增殖并阻止其分化, 但 使用不便。分泌成分复杂的因子与使用致癌剂如: 丝 裂霉素等使其难以用于 E S 细胞分化启动和关闭分 子机制的研究。 S m itn 和 H oop e r ( 1983) 5 研制了一 种条件培养基 (Co n d i t i o n ed m ed i u m , C M ) , 它可以替
收稿日期: 2000203207
基金项目: 国家自然科学基金资助 ( 39670359) , 国家攻关课 题资助 ( 962C 01203) , 校青年教师专项基金资助
作者简介: 安立龙 ( 1966- ) , 男, 西北农林科技大学畜牧兽医 学院博士, 副教授, 主要从事动物环境与生殖生物学研究。
邱 怀
化。S m ith (1992) 认为, D I A 和 L IF 是同一种物质, 在
无 饲 养 层 细 胞 的 条 件 下, 向 培 养 基 中 加 入 L I F ( 10
n g ƒm L ) , 可 维 持 E S 细 胞 和 EC 细 胞 的 多 能 性5
。
L IF 的 m RN A 在早期胚胎中含量高, 可维持胚胎细 胞的全能性, 并促进增殖。在发情母畜的生殖道, L IF
m RN A 及 L IF 含量高, 高水平 L IF 有利于促进早期 胚胎增殖, 防止其分化。 Y an be r W u 认为, L IF 也可
完 全抑制 TN F 2 (T u m m o r N ec r o sis fa t o r , 肿 瘤 坏 死 代饲养层而被用于分离和克隆 E S 细
胞。其方法是将 基础培养液用 0. 2 Λm 滤膜过滤, 用该条件培养液培 养胚胎瘤细胞, 能促进细胞增殖, 抑制由叶酸 (R e t in
o t i c ac i d RA ) 和 D M S O 诱导的细胞分化。 用大鼠肝
培养液作培养基, 在无饲养条件下分离和克隆了小
鼠 E S 细胞。大鼠肝条件培养基 (B R CM ) 的制备方法 是, 从大鼠肝脏中分离 B RL 细胞, 将 B RL 细胞在培
养板 (175 c m 2 ) 培养, 待细胞贴壁后, 加入 30 m L 培
养基 (E e ag l e s M ed iu m + 非必需氨基酸如 L 2G l u 、L 2
A sn 、L 2A sp 、G ly 、L 2A la + 0. 1m M Β
2巯基乙醇+ 0. 1 m m o l ƒL 丙 酮 酸 钠 + 100 m o l ƒL 胎 牛 血 清) , 在 37
℃, 5% C O 2 中培养, 每 3 d 收集 1 次大鼠肝条件培养 液。每个大鼠肝细胞饲养层可用 21 d 。用于制备条件 培 养 基 的 其 它 细 胞 还 有: HB C ( 人 膀 胱 癌 细 胞 株 5637) , P S A 21 (一种小鼠 EC 细胞) , PC 1026R (L IF 转 染的小鼠胎儿 成 纤 维 细 胞) , T 3 细 胞 ( 一 种 小 鼠 EC
细胞)。 尽管用 C M 含有 500～ 5 000 I U ƒm L L I F 分 离和克隆 E S 细胞, 可 以 更 准 确 地 研 究 某 一 因 子 对 E S 细胞生长的影响, 而排除细胞接触抑制作用及饲 养层细胞分泌其它因子的干扰, 但 CM 只能在短期 传代中维持 E S 细胞全能性及核型正常。
在 CRL aa + 0. 1 m m o l ƒL 亚硒酸钠+ 10 n g ƒm L 胰岛素+ 10 Λg ƒm L 转铁蛋白+ 50 m o l ƒL FC S + 10
n g ƒm L L IF 培养系统中低密度悬浮培养体外受精牛
胚胎, 并用免疫外科手术法分离 I C M 。 该 I CM 在该 培养基中培养 101 d 仍保持未分化状态。用这种方法 建立了 15 个培养的 I CM 细胞系。 由培养的 I C M 细 胞进行核移植获得了 34 枚囊胚, 移入 27 个受体后,
13 头妊娠, 最终产下 4 头犊牛6 。
3 分化抑制因子 (D iffe r en t i a t i o n i n h i b ito ry ac t i v i ty , D I A )
3. 1 分化抑制因子对 E S 细胞分离与克隆王心凌身高
的影响
饲养层对 E S 细胞的分化抑制是其分泌多种因 子共同作用的结果, 起主导作用的是白血病抑制因 子 (L euk em ia in h ib ito ry fac t o r , L IF )。L IF 是一种天 然的细胞因子, 其能诱导小鼠白血病细胞分化并抑 制其增殖, 具有广泛的生物学活性
7, 8
。L IF 是高度糖
基化分泌型蛋白。 其去糖基化核心蛋白的氨基酸组
成在多种哺乳动物中有高度的相似性。 在饲养层细 胞的培养基中添加L IF (10 n g ƒm L ) , 能促进 P G C s 细
胞增殖并防止其分化9
。 在无饲养层培养液中添加 L IF ( 10 n g ƒm L ) , 能抑制 E S 细胞分化, 促进其细胞 增殖, 形成具有全能性 E S 细胞。从小鼠 STO 饲养层 细胞培养液中提取的 D I A , 能部分抑制 EC 细 胞 分
因子) 诱导的 E S 细胞的分化11 。Yan g (1994) 等12
用
小鸡肝细胞条件培养基或原代鸡胚成纤维细胞饲养
层获得了 10 代以上小鼠 E S 细胞克隆, 证明禽类细
欠条的有效期是多少年胞也能产生一种 D I A 样因子, 抑制小鼠 E S 细胞的 分化。对小鼠而言, 在一定浓度范围内, L IF 与 E S 细
胞克隆效率之间存在量效关系13
。 当 L IF 浓度达到
1 000～ 5 000 I U ƒm L 时, 从增殖的 I C M 分离 E S 细 14 胞的效率可达 95% 以上。Co n gue t 等 将外源 L IF 基因引入小鼠 E S 2D 3 细胞, 得到过度表达外源 L IF
基因的 E S 细胞。这种细胞可以在无饲养层无L IF 的
15
条件培养液中传 6～ 7 代。杜宪兴等 将人 D 型 L IF 的 c DN A 以正反两种方向分别引入小鼠 E S 25 细胞,
建立了过度分泌 L IF 的 E S L ( + ) 细胞株和表达外源 反义L IF 的 R N A 的 E S L (- ) 细胞株。发现一株 E S L
(+ ) 细胞能在无外源 L IF 的常规培养液中至少传 13
代以上, 并保持 E S 25 的特征。 这表明过度表达 L IF 的 E S 细胞能完全脱离外源 L IF , E S L ( - ) 细胞对培
养液中L IF 浓度的依赖性明显升高, 也更易分化。说
明 E S 细胞内源 L IF 基因的表达水平虽低, 但对于抑 制小鼠 E S 细胞的分化是必需的。
M e i n eck e 2T ill m ann 研 究 表 明, 单 纯 L IF 或 BRL 2C M 对山羊和绵羊 E S 细胞无促进作用 (以胎牛
肝 成纤维细胞作饲养层)。L i 和 T ro un so n ( 1990) 认
为绵羊类 E S 细胞在 L IF 存在时发生分化形成类胎 体。 但 S m ith 认为, 这种 L IF 是已分化 E S 细胞分泌
的, 其 目 的 在 于 维 持 未 分 化 E S 细 胞 的 全 能 性。
H o c h e r au be k e v i e r s (1992) 未发现 L IF 对牛和猪 E S
细胞有积极的作用。尽管有些学者在分离 E S 细胞时 使用外源 L IF 效果不显著, 但并不排除饲养层细胞
分泌的L IF 的作用。L IF 对动物 E S 细胞分化抑制作 用存在着种属差异16 。
用 含 重 组 L IF ( 1 000 I U ƒm L 或 10 n g ƒm L ) 的 DM EM 培养液培养 E S 细胞 ( 无饲养层) , E S 细胞在
60 d 内未分化。 将在 L IF 培养液中传至 16 代的 E S
细胞注射到囊胚中, 获得 3 种嵌合体小鼠, E S 细胞
参与 60%～ 80% 的组织发育。 将小鼠囊胚在含有 1
000 I U ƒm L L IF (无饲养层) 的培养液中培养, 直接从 囊胚中分离到了 E S 细胞, 所获得的 E S 细胞有 40 个
染体, 核型正常, A KP 染呈阳性, 将这种E S细胞注射人囊胚, 获得了生殖腺嵌合体小鼠17 。L IF (
10 n gƒm L ) 可显著减少10. 5 d 鼠胚分离的P G C s 的分化。在含有L IF 培养基培养的P G C s 保存率为95% ，不含L IF 培养基的P GC s 保存率为72% , 但L I F 并不能增加每个集落的细胞数18 。
L IF 也具有促进细胞增殖的作用, 用L IF 处理胚胎, 能加速胚胎孵化, 提高胚胎存活率。L IF 也可促进滋养层细胞和I CM 细胞增殖, L IF 是通过抑制细胞程序性死亡而使I C M 和E S细胞数增加19 。
3. 2 分化抑制因子作用的机理
L IF 抑制E S 细胞分化作用机理尚不十分清楚, 但已有一些研究成果, 主要表现在: L IF 基因是单拷贝基因, 有两个转录起始位点, 经过不同的剪接过程, 最终就产生了D 型和M 型L IF。其中D 型L I F 主要存在于细胞间液, 随体液循环而扩散; M 型L IF 附着于细胞外基质上, 成为基质的组成部分。饲养层细胞主要通过分泌M 型L IF 发挥对E S 细胞分化的抑制作用20 , 同时也产生大量的D 型L IF。而商品化的L IF 都是D 型。不同物种E S 细胞对L IF 的反应不同, 可能是由L IF 细胞受体类型差异造成的。L IF 有高亲和力和低亲和力两种受体。连接亚单位与转换器分子间的比例变化可使某些细胞表面受体的L IF 亲和力不同。细胞因子的受体同其“转换器”分子相互作用就会产生第二信使, 使细胞因子对某些类型的细胞具有生物学活性。而各种的细胞因子与受体和“转换器”相互作用产生的第二信使, 导致各种细胞因子的生物学活性不同。
4 小结
哺乳动物E S 细胞在研究细胞分化、胚胎发育以及生产转基因动物方面具有极大的应用潜力。E S 细胞能够发挥巨大作用的基础是E S 细胞的全能性和多能性。在胚胎及E S 细胞的培养过程中, 抑制细胞分化, 促进细胞增殖是关键的技术环节。小鼠胎儿原代成纤维细胞饲养层可分泌L IF , 碱性成纤细胞生长因子和胰岛素样生长因子, 对于小鼠胚胎具有抑制E S 细胞分化, 并促进增殖的作用, 但由于各种动物胚胎发育的差异, 小鼠胎儿原代成纤维细胞饲养层并非所有动物E S 细胞分离的最佳选择。条件培养液中含有分化抑制因子和促细胞增殖因子, 但其分泌量只能满足E S 细胞短期培养的要求。因而条件培养液在胚胎干细胞培养中使用并不广泛。值得指出的是, 小鼠胎儿成纤维细胞分泌的细胞因子难以支持某些动物E S 细胞的增殖, 添加某些细胞因子, 可进一步提高E S细胞克隆率。我们的实验结果表明, 在饲养层体系中加入L IF 和胰岛素生长因子, 可提高牛类E S 细胞克隆率。L IF 可抑制各种动物的胚胎细胞、E S 细胞、原始生殖细胞和畸胎瘤细胞的分化, 保持其全能性和多能性。L IF 在胚胎干细胞分离培养中具有广阔的应用前景。有关人工合成L IF 的技术已成熟, 在培养基中添加L IF ，是提高动物E S细胞克隆的重要举措。
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( 1. S h a n x i A g r i cu l t u re U n i v ers ity 020801; 2. I nst itu te of A n i m a l Q u a ra n t i m e , D ep a r t m en t of A g r i cu l t u re , 266032, C h in a
) A bstra c t : It is i m p o r t an t th a t th e de t ec t i o n o f sa l m o n e lla sp e c i e s i n foo d . In th is repo r t , th e
p r i n c i p le s o f a ll k i n d s o f rap i d m e t ho d s fo r de t ec t i o n o f sa ll m o n e lla a re i n t r o d u c ed i n de t a i ls , an d th e i r app li ca t i o n s an d deve l opm en t s i n foo d h y g i en e is rev i ew ed. I mm u n om a rk e r tech n i qu e s , ce llu la r an d m o lecu l a r b i o l o g i ca l tech n i qu e s h a ve b e en deve l op e d i n th e de t ec t i o n o f Sa l m o n e lla du e to th e ir sen s t i v ity an d sp i cef i c ity du r i n g th e p a s t decade s . E L I S A an d PCR h ave b een app li ed i n de tec t i o n o f c li n i c sam p le s . In add it i o n , seve ra l n e w f o r e i g n m e tho d s fo r de tec t i o n o f Sa l m o n e lla a re i n t ro du ced . A t la s t w e p ro sp ec t th e d irec t i o n o f deve l opm en t an d p e r sp e c t i ve o f app li ca t i o n o f th e m e tho d s fo r de tec t i o n o f Sa l m o n e l l a i n th e fu t u r e .
Key word s : Sa l m o n e l la; rap i d de t ec t i o n m e t ho d ; i m m u n om a rk e r
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