(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210451511.X
(22)申请日 2022.04.27
(71)申请人 江苏华熙益能生物科技有限公司
地址 214028 江苏省无锡市新吴区菱湖大
道99-2号303
非诚勿扰 王茜
申请人 北京华熙荣熙生物技术研究有限公
司　
华熙生物科技股份有限公司
(72)发明人 张伟平　张晨　高萌　张天萌　
王瑞妍　
(74)专利代理机构 北京唐颂永信知识产权代理
紫菜蛋花汤怎么做
有限公司 11755
专利代理师 刘伟
(51)Int.Cl.
C12N  15/10(2006.01)
C12N  15/11(2006.01)
(54)发明名称多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法(57)摘要本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：获取鲑鱼基因组DNA，采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。本申请还提供一种多聚脱氧核糖核苷酸，所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于400bp的片段占比大于90％，大于等于1000bp的片段占比小于2％。本申请提供的方法通过合成生物学技术，仅需引入少量外源蛋白(Phi  DNA聚合酶)，即可大量合成鲑鱼精DNA。此外，本申请合成的鲑鱼精DNA不是全长的基因组DNA(genome  DNA ,gDNA)而是片段大小处在12kb～100kb的长片段DNA；通过复合物理破碎方法和生物处理手段，可在短时间内获取大
量分子量大小理想的PDRN样品。权利要求书1页  说明书8页  附图2页CN 115109775 A 2022.09.27
C N  115109775
A
1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：获取鲑鱼基因组
DNA，
采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，
将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段包括以下步骤：
对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板，
中和处理所述模板，
将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行多重置换扩增，
对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述随机引物在PCR体系中的浓度为0.2‑1.0μM。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，多重置换扩增的时间为2‑4h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述打断包括超声处理和/或酶切处理，优选地，所述打断包括首先进行超声处理，然后进行酶切处理。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声功率为200‑400W、占空比为1:0.5‑2，超声处理时间为10‑60min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶切处理使用浓度为50‑100U/ml 的限制性内切酶Sau  3AI在37‑40℃恒温处理1‑2h。
bl穿越文8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA 片段打断之后去除蛋白、沉淀得到鲑鱼DNA片段的步骤。
9.一种多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，
进一步优选长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优选大于50％，张晓龙 康熙来了
进一步优选长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％，
进一步优选长度大于等于1000bp的片段占比小于10％，优选小于2％。
10.根据权利要求9所述的多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸通过权利要求1‑8中任一项所述的制备方法制得。
权　利　要　求　书1/1页CN 115109775 A
多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法
技术领域
[0001]本申请属于生物工程领域，具体地，涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法。
背景技术
[0002]多聚脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotide,PDRN)是源自鲑鱼、鳟鱼或大马哈鱼等精巢或精液中的一类天然生物活性物质，其本质是一种分子量大小处在50～1, 500KDa的脱氧核糖核苷酸结合体。由于鲑鱼基因组在碱基结构和构成比例上与人类基因组的高度相似性(≥95％)，因此经过严格处理纯化后的PDRN不存在免疫原性且具有高度的安全性和稳定性。体外和体内实验表明，细胞表面的腺苷A2A受体通过识别腺苷受体激动剂PDRN，可以起到调节炎症、降低细胞耗氧量、改善组织局部缺血、促进细胞生长和血管生成的作用。此外，PDRN通过参与“补救合成途径”可以为细胞生长提供核苷和核苷酸，延长细胞寿命，改善细胞状态。总之，PDRN作为一种新的功能性原料具有组织修复、促
进伤口愈合以及延缓衰老等作用，目前已经被广泛应用于医药、化妆品、食品和保健品等领域。
[0003]富含DNA的鱼类精巢和精液是提取PDRN的理想原料。然而，受到石油泄漏、核废水排放以及船舶污染等带来的重金属超标、基因突变和染体畸变等意料之外的风险，通过鲑鱼精巢或精液直接提取PDRN不再作为最佳选择。此外，深海鲑鱼种作为一种生态系统的重要组成部分，现代渔业捕捞很容易导致海洋生态系统退化、种灭绝等风险。21世纪是生物技术大爆发的时代，其中合成生物学通过工程化的策略，可以有目的地设计合成标准化的生物元件，构建特定的基因回路，组装具有特定功能的人工生命系统，从而定向地人工合成多种原料、药物和生物能源等等。多PDRN的生产过程主要分为DNA提取和DNA打断两大工艺步骤，其中现有的工业DNA提取方法包括醇沉法、盐析法和柱层析法等，DNA打断方法有物理破碎法(超声破碎)和生物破碎法(酶切处理)等。例如专利CN107287186A公开的一种从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法通过盐析法纯化鲑鱼DNA并通过物理破碎法获取PDRN；专利CN106031709B(辉文授权)公开的一种鱼精DNA‑NA、鱼精蛋白提取物及其制备方法使用柱层析法获取高浓度的鱼精DNA‑NA提取物；专利CN112315836A公开的一种高效的外用PDRN的制备方法通过醇沉法获取高纯度DNA再经由限制性内切酶处理获取高质量PDRN。由于是从动物细胞中直接提取DNA，工业DNA提取工艺很容易造成大量蛋白残留。PDRN生产过程中单一的打断处理不仅具备功耗大、成本高和反应时间长的缺点，而且并不总能获取理想的分子量大小。例如专利CN107287186A未测量样品中蛋白残留量且缺乏关键性证据表征分子量大小及分布区间；专
利CN106031709B获得的DNA样品中蛋白残留量为2.5～5％且并未提及分子量大小及分布区间；专利CN112315836A虽然蛋白残留量低于1％且PDRN分布范围较为理想，但是在DNA打断过程使用单一酶切处理(37℃恒温孵育16h)不仅成本高昂而且反应时间较长。
发明内容
类似沧月的小说[0004]针对现有技术存在的问题，本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法。
[0005]具体来说，本申请涉及如下方面：
[0006]  1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
[0007]获取鲑鱼基因组DNA，
[0008]采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。
[0009]  2.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA 制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段包括以下步骤：
[0010]对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板，
[0011]中和处理所述模板，
[0012]将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行多重置换扩增，
阮经天 刘品言[0013]对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。
[0014]  3.根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述随机引物在PCR体系中的浓度为0.2‑1.0μM。
[0015]  4.根据项2所述的制备方法，其特征在于，多重置换扩增的时间为2‑4h。
[0016]  5.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述打断包括超声处理和/或酶切处理，优选地，所述打断包括首先进行超声处理，然后进行酶切处理。
[0017]  6.根据项5所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声功率为200‑400W、占空比为1:0.5‑2，超声处理时间为10‑60min。
[0018]7.根据项5所述的制备方法，其特征在于，所述酶切处理使用浓度为50‑100U/ml的限制性内切酶Sau 3AI在37‑40℃恒温处理1‑2h。
[0019]8.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA片段打断之后去除蛋白、沉淀得到鲑鱼DNA片段的步骤。
[0020]9.一种多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，
[0021]进一步优选长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优选大于50％，
[0022]进一步优选长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％，
[0023]进一步优选长度大于等于1000bp的片段占比小于10％，优选小于2％。
[0024]10.根据项9所述的多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸通过项1‑8中任一项所述的制备方法制得。
[0025]针对工业DNA提取过程中蛋白残留和单一打断处理的缺点，本申请提供了一种恒温扩增生物合成多聚脱氧核糖核苷酸的方法。通过合成生物学技术，仅需引入少量外源蛋白(Phi DNA聚合酶)，即可大量合成鲑鱼精DNA。此外，本申请合成的鲑鱼精DNA不是全长的基因组DNA(genome DNA,gDNA)而是片段大小处在12kb～100kb的长片段DNA；通过复合物理破碎方法和生物处理手段，可在短时间内获取大量分子量大小理想的PDRN样品。
附图说明
[0026]图1为不同反应条件的PDRN的凝胶电泳图，其中A显示不同引物浓度(0.2～1.0μM)
的凝胶电泳图，B显示不同反应时间(2～4h)的凝胶电泳图；
[0027]图2为不同超声条件的PDRN的凝胶电泳图，其中A显示不同超声时间(10～60min)的凝胶电泳图，B显示不同超声功率(200～400W)的凝胶电泳图，C显示不同占空比(1～2:1～2)的凝胶电泳图；
[0028]图3为核酸/蛋白分析仪测定的实施例制备的PDRN的片段分布结果；
[0029]图4为核酸/蛋白分析仪测定的对比例制备的PDRN的片段分布结果；
[0030]图5为凝胶电泳测定的实施例和对比例制备的PDRN的片段分布结果。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
[0032]除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思
相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
[0033]本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0034]步骤一：获取鲑鱼基因组DNA。
[0035]步骤二：采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，[0036]步骤三：将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。
[0037]在步骤一中，鲑鱼基因组DNA可以通过现有的技术从鲑鱼中提取获得。例如可以通过传统的酚氯仿抽提法，或者试剂盒获取纯净的鲑鱼基因组DNA(genomic DNA,gDNA)。传统的酚氯仿抽提方案使用酚/氯仿分离有机相和水相，从而实现核酸的提取。虽然酚氯仿抽提可获得产量可观的gDNA，但是由于涉及有毒有害试剂的使用，因此其不适宜工业化大规模生产。而市售的试剂盒虽然可获得较为纯净的gDNA，但是gDNA的得率较小且成本昂贵也较难实现工业化。因此，本申请采用试剂盒提取的少量gDNA(鲑鱼gDNA)作为模板，通过多重置换扩增技术可获得大量鲑鱼gDNA，且反应过程中不涉及任何有毒有害试剂的使用。[0038]在步骤二中，所使用的重置换扩增技术(M u l t i p l e d i s p l a c e
m e n t amplification,MDA)是目前最常用的全基因组扩增方法，该方法在30℃恒温条件下，通过随机引物与模板DNA的随机退火结合，在高保真、强链置换活性Phi29 DNA聚合酶的作用下，可在短时间内合成大量12kb～100kb的扩增片段。
[0039]进一步地，采用多重置换扩增制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段可以包括以下步骤：对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板；中和处理所述模板；将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行多重置换扩增；对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。
[0040]其中，将DNA由双链处理为单链可以通过本领域任何已知的变性方法进行。[0041]phi29 DNA聚合酶是从嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。
[0042]phi29 DNA聚合酶具有特殊的链置换和连续合成特性，可连续合成长达70kb的DNA