34中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期Chinese Journai of Veterinao Medicine
AMA1蛋白i
隆抗体的制备及其鉴定
罗伏兵1，刘晓冬J梁琳2，刘贤勇3，徐发荣1，沈光年1，马志军J索勋3，汤新明2（1.北京市动物疫病预防控制中心，北京大兴102629&  2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
北京海淀100193；  3.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）
摘要：为了研究巨型艾美耳球虫顶膜抗原1(AMA1)的细胞定位及功能，制备了抗AMA1的单克隆抗体并进行了鉴定$首先，用大肠杆菌(DE3)表达了巨型艾美耳球虫AMA1蛋白，蛋白经纯化后免疫小鼠，测定小鼠血清中AMA1抗体滴度$然后进行杂交瘤细胞的制备和克隆筛选，获得了16株分泌产生AMA1抗体的杂交瘤细胞株。最后用免疫印迹和间接免疫荧光试验对单克隆抗体进行$结果显示，为21和34的杂交生的抗体可识别巨球虫可溶性抗原中的AMA1组分；编号为34和35的抗体与巨型艾美耳球虫子抱子反应后，荧光信号集中于子抱子的顶质体和细胞膜部位。本试验制备的抗AMA1的单克隆抗体，为巨型艾美耳球虫生物学和免疫学研究提供了科学依据$关键词：巨球虫；顶膜抗原1；单克隆抗体；免疫印迹；免疫荧
中图分类号：R382.3+2文献标志码：A文章编号：0529-6005(2020)11—0034—03
Preparation and Application of Monoclonal Antibodies against
Apical Membrane Antigen1of Eimeria maxima
LU0Fu-bing1，LIU Xiav-dong1，LUNG Lin2，LU Xian-yong3，XU Fa-ong1，
SHEN Guang-nian1，MA Zhi-jun1，SU0Xun3，TANG Xin-ming2
(1.BeiiingCenteoeooAnimaeDiseaseContooeand Poeeention，Beiiing102629，China；  2.InstituteoeAnimae
Sciences，Chinese Academy of Agriculturai Sciences，Beijing100193，China；3.Colleye of Veterinao
Medicine，ChinaAgoicuetuoaeUnieeosity，Beiiing100193，China)
Abstracr: To study the cellular localization and function of apicai membrane antigen1(AMA1)of Eiperic maxica，monoclonai antibodies ayainst AMA1were prepared and identified.The mice were ir
nmunized with recombinant AMA1protein expressed by E. coli(DE3).Then，hybridoma celt preparation and clonai screening were performed，and16hybridoma celt Ones producing AMA1an­tidodies ，the monoclonai antibodies were identified by Western Blot and indirect iRmunoXuorescenco assay. The results showed that the antibodies produced by the hybridoma celt Ones numbered21and34could recognize the native AMA1of the E.maxima soluble antigen.The antidodRs numbered34and35oacted with E.maxima sporozoites with the fuorescence signai concentrated in the apicai and celt membrane of the sporozoite.The monoclonai antibodies ayainst AMA1prepared in this study laid the foundation for the biologicai and immunologicai research of E.maxima.
Key words:Eimeria maxima；AMA1；monoclonai antidody；Western Blot；indirect iRmunoXuorescenco assay
Corresponding author：TANG Xin-ming，E-maii:tangxinming@caas
杨树苗扮演者鸡球虫病是艾美耳球虫感染引起的严重危害鸡业的寄生，全球年因球造成的损失高达30[1]$为组分的球疫苗数十年的应用历史，影响鸡生产性能
收稿日期：2020—08—10
基金项目：北京市家禽产业创新团队（BAIC04-2020）
大专最有前景的专业张根硕回应朴信惠结婚作者简介：（1978-），男，高兽医师，硕，主要从事动物疫病诊断及综合防治技术方面的研究，E-maii:fubingluo@ 163
通讯作者：汤新明，E-mail:tanyxinming@caas 的风险。开发高效的基因工程球虫病疫苗是学界研究的热点。顶膜抗原！Apicct membrana anti­gen，AM A）门生分泌的I型跨膜，区、跨膜区和胞外区组成$AMA1蛋白门原虫中高度保守，表•平高[2]，可能参与入侵$巨
球虫AMA1（EmAMA1）被认为是免疫原性较好的保护性抗原，具备开发成为亚单位疫苗的潜能[3]$因此，深入解析EmAMA1的生物学和免疫学功能重要$单克隆抗高特异性、均一
Chinese Journai of Veterinaa Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期35
警钟胸
性以及方便生产的特点，是病原学或血清学检测技术、感染与免疫机制等研究的主要工具之一。本试验旨在构建一/多株抗EmAMA1的单克隆抗体，为EmAMA1基因功能和应用研究提供科学依据$
1材料与方法
1-1试验材料巨型艾美耳球虫北京株（中国农业大学动物医学院保存）；SP2/0骨髓瘤细胞；次黄瞟吟-
氨甲蝶吟-胸腺嚏睫核2（HAT）；HRP标记的山羊抗小鼠IgG；SBA Clonotyping System-HRP；BALB/c雌性小鼠（购自北京华阜康生物科技股份有限公司）。
1.2动物免疫利用PCR从pSDEP2AAMA1S[4]扩增EmAMA1序列后，连接至pEt28a载体，转化至DE3菌株进行蛋白的诱导表达。获得大肠杆菌重组表达的EmAMA1蛋白，纯化后，按每只100$g（加弗氏完全佐剂）颈背部皮下多点注射免疫4只BALB/c雌性小鼠；间隔2周后，以相同操作进行加强免疫，剂量为每只小鼠30$g蛋白（加弗氏不完全佐剂），加强免疫3次。于最后1次免疫后第10天，眼眶取血，分离血清。用间接ELISA方法检测小鼠血清中EmAMA1的抗体效价$
1.3抗体检测以纯化的EmAMA1（0.1$g/孔）包被96孔酶标板,4k过夜；每孔加200$L脱脂乳封闭液,37k封闭2h；每孔加入小鼠血清（不同稀释度）或细胞培养上清，每孔100$L，37k孵育1h；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1:20000倍稀释），100$L/孔,37k孵育1h；加入TMB底物溶液,100$L/孔，避光显5min左右；每孔加入2moIL H2S04,100$L/孔，终止反应。用酶标仪测定双波长（0D450nm,0D aQ n m），记录保存数据$
1-4杂交瘤细胞株的建立依据单克隆抗体的制备步骤进行。简言之，抗体滴度符合要求的小鼠（4号小鼠），腹腔注射50$g蛋白，进行加强免疫。免疫后3d取小鼠脾脏，制备脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞按比例混合，按照PEG法进行细胞融合。融合完的细胞均匀倒入30个半固体培养基（含HAT），置
37k、5%CO?培养箱中进行筛选培养。每个培养基分别挑93个克隆培养在铺满胸腺细胞的96孔板中,3d后，按1.3所述方法筛检分泌特异性抗体的阳性孑L，得到阳性杂交瘤细胞株；用“AMA1”“His标签”包板，做第2次筛选；将2次筛选出来的阳性细胞株进行亚类鉴定，得到IgG类型阳性杂交$1-5单克隆抗体的纯化与鉴定选择其中的3株阳性杂交瘤细胞按体内腹水法进行大量制备，送至北京华大蛋白质研发中心有限公司进行蛋白质纯化,SDS-AGE以及ELISA检测抗体纯度及亲和常数，分装后冻存于-80k，备用$
1-6单克隆抗体的初步应用
1.6.1单克隆抗体与全虫抗原的反应性检测用巨型艾美耳球虫全虫抗原进行SDS-PAGE电泳，通过半干转印法将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后，取稀释（1：5000）的腹水作为一抗进行Western Blvi检，抗与AMA1的异反应性$
1-6-2单克隆抗体检测EmAMA1在巨型艾美耳球的表分将的巨球
提取子抱子，取稀释（1：2000）的腹水作为一抗进行间接免疫荧光试验，分析单克隆抗体与虫体天然抗原的结合特性与检测EmAMA1在子抱子阶段的表与分$
2结果
2.1获得分泌抗EmAMA1抗体的杂交瘤细胞株
小鼠经重组EmAMA1蛋白免疫后，产生了针对EmAMA1的特异性抗体（见中插彩版图1），选取4号小鼠再次进行加强免疫。取免疫后小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经第1次阳性筛选，获得47性杂交；第2次性选，得到19株阳性杂交瘤细胞株。将筛选出来的19株阳性细胞株进行亚类鉴定，得到16株IgG类型阳性杂交$
2.2单克隆抗体与巨型艾美耳球虫可溶性抗原特异性反应巨球抗原SDS-PAGE 分，得的16单克抗进行免疫印试验。结果显示，编号为21与34的单克隆抗体与全虫抗原反应后，出现清晰的目的条带（约60kDa），说明这2株单克隆抗体均能够识别巨型艾美耳球虫中异性的EmAMA1组分（2）$
2.3EmAMA1在巨型艾美耳球虫子抱子的表达分布为了验证获得的单克隆抗体能否识别巨型艾美耳球虫EmAMA1抗原，进行了间接免疫荧光试验$结果显，选得的16单克抗,
编号为34和45的单克隆抗体能够识别巨型艾美耳球虫子抱子的AMA1，在顶质体和胞浆中检测到特异性的荧光信号（见中插彩版图3）$结果表明，编号为34和45的单克隆抗体与EmAMA1具有良好反应性，为研究EmAMA1蛋白的表达分布及免疫学性提了学依$
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kDa 100
70
225912192022232527323438214445
图2利用免疫印迹试验筛选与巨型艾美耳球虫可溶性蛋白反应的抗EmAMAI单克隆抗体Fig.2Selectinn of monoclonal antibodins against EmAMAI that reacted with native"maxima
soluble antigens by Western Blot
孛儿只斤包迪3讨论
本文筛选获得了16株抗巨型艾美耳球虫AMA1蛋白的单克隆抗体，其中2株（编号为21和34）能够与巨球虫可溶性抗原发生特异性反应；2株（编号为34和45）能够用于检测EmAMA1在子抱子阶段的表达与分布$初步证实编号为34的单克隆抗体可用于后续EmAMA1基因功能和免疫学的研究。
顶复门原虫种类繁多，包括疟原虫、弓形虫、巴贝斯虫、艾美耳球$与疟原虫和弓形虫相比，球因功能的研究相对，其原因在于一是艾美耳球虫尚不能进行有效的体外培养，导致反向遗传平台效率极低（5）；对
美耳球虫研究的一些工具或试剂，比如单克隆抗体相对。已报道的研究中，球单克隆抗体主要集中于球虫的，其他细胞器或虫种的单克隆抗体极少（5V）$巨「美耳球虫是7种鸡球虫中免疫原性强的虫种，经口免疫5个抱子化的卵囊即可产生免疫力（2）$研究表明，巨型艾美耳球虫AMA1蛋白为其保护性抗原之一，基于EmAMA1的DNA或重组蛋白亚单位疫苗能够为鸡提供部分抵抗巨球虫感染的免疫保（3,5）$球为疫苗表达EmAMA1的重组球虫同样能够提供一定的免疫保护力（4）$巨球虫激发生的免疫应答及保护性免疫的分子机理仍不清楚。本文制备了针对EmAMA1的单克隆抗体，为研究巨型艾球虫激发宿主产生免疫应答的机理提供了科学依据$4结论
本文选得了1抗巨球AMA1蛋白的单克隆抗体，可用于后续EmAMA1基因功能和免疫学的研究$
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Chinese Oournal of Veterinary Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期
《巨型艾美耳球虫AMA1蛋白单克隆抗体的制备及其功能鉴定》图版
（作者：罗伏兵，汤新明等，正文见第34：36页）
2.0r
20040080016003200640012800 2560051200102400空白阴性
血清稀释倍数
Serum dilution factor
图1加强免疫后小鼠血清中EmAMAI特异性抗体水平
Fig.1Recombinant EmAMAI specific antibody titet in serum after the3rd boosi immunizatinn
anti-EmAMA1(34)DAPI
■
c Ur L__Lr__
anti-EmAMA1(34)DAPI Overlay
■
■
图3利用间接免疫荧光试验筛选与巨型艾美耳球虫子苞子反应的抗EmAMA1单克隆抗体(标尺=5^m)
Fig.3Seloctinn of monoclonal antinodins against EmAMA1that raacted with E.maxima sporazoites by
indirect immunofluorascent assay(Bar=5(jim)