dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法一年级语文下册期末试卷
1、 连接缓冲液的阻碍：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范畴在7.4-7.8，较多 用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L， 作用是坚持还原性环境，稳固酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是 连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
2、 pH的阻碍：一样将缓冲液的pH调剂到7.4-7.8，较多用7.8。有实验说明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。汽车轮胎寿命
3、 ATP浓度的阻碍：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发觉，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，因此当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题
外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于 -20℃储存，溶化取用后赶忙放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长 期放置后往往失效，因此也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期储存），临用时加入新配制的ATP母液。
4、 连接温度与时刻的阻碍：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，因此温度过高会使氢键不稳固，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经 过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时刻为4-16h。现经实验发觉，关于一样的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接成效，因此假如时刻充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。关于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。
5、 酶浓度的阻碍：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶储存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时刻保持活力，也便于随时取用。佟丽娅结了几次婚
6、 DNA浓度的阻碍：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一样可不能超
过20nmol/L苏志燮。要求线性化的连接产物， DNA的浓度能够高些，至少是接近举荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓月亮的古诗 度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，因此，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。
提高平端连接效率的方法：
1、 朴有天和尹恩惠低温下长时刻的连接效率比室温下短时刻连接的好，平端连接需要过夜反应。
2、 在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原先的酶切位点消逝。如此可幸免载体自连，应该能够大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的 。要段具体情形而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，那个专门关键。 载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。
3、 平端的连接关于离子浓度专门敏锐，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。
4、 尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。
5、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。
（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应
  外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也确实是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但假如质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情形 下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶确实是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶差不多上首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。