口腔医学2021年1月第41卷第1期・1・
王琦沈佳娣"，吴欣祎"，谢海峰陈晨-2
［摘要］目的分析10-MDP-钙盐形成对牙本质粘接成绩的影响"方法釆用酸蚀冲洗粘接模式，根据牙本质表面的处理方式和选择粘接剂的不同将牙齿随机分为以下4组(n=5)进行处理，制作牙本质/树脂粘接试件:①对照组，直接使用全酸蚀粘接剂Single bond2(SB2)处理后粘接;②10-MDP组，使用SB2处理进行粘接前，牙本质表面以含有磷酸酯单体10-MDP的自配底涂剂预处理;③CHX组，使用SB2处理进行粘接前，先以氯己定(CHX)预处理牙本质表面;④SBU组，使用包含10-MDP 的通用型粘接剂Single bond universal(SBU)处理后进行粘接。通过微拉伸测试(“TBS)测试粘接强度，以X射线衍射(XRD)、原位酶谱测试表征自配10-MDP底涂剂和两种牙本质粘接剂处理的牙本质表面，分析10-MDP-钙盐形成对牙本质粘接成绩的影响。结果微拉伸结果显示，不同处理方式的粘接试件在24h水储后没有表现出明显的统计学差异(P>0.1)；经过6个月的水储后，与10-MDP组和SBU组相比，对照组的微拉伸强度显著降低(P<0.05)，而CHX组的微拉伸强度没有明显变化(P> ().05)。XRD结果显示，在10-MDP组和SBU组均检测到10-MDP-钙盐形成的特征性峰，表明有10-MDP-钙盐的形成。原位酶谱结果显示,10-MDP组与SBU组之间混合层荧光强度没有明显区别，但均明显高于对照组,CHX组荧光强度低于10-MDP组与SBU组。
结论10-MDP-钙盐的形成能够保护暴露的胶原纤维不接触到MMPs而免于水解，从而增强牙本质/树脂的粘接成绩。
［关键词］牙本质粘接；MMPs；10-MDP；MMPs抑制剂
［中图分类号］R783.1［文献标识码］A［文章编号］1003-9872(2021)01-0001-05neither是什么意思
［doi］10.ki.kqyx.2021.01.001
Evaluation of the effect of10-MDP-calcium salt formation on dentin bonding performance
WANG Qi,SHEN Jiadi,WU Xinyi,XIE Haifeng,CHEN Chen.(Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases,Nanjing Medical University, Nanjing210029,China)
Abstract:Objective To analyze the effect of10-MDP-calcium salt formation on dentin bonding performance.Methods Using the etch-and-rinse technique mode,the teeth were randomly divided into the following4groups(n=5)according to the treatment method of the dentin surface and the choice of the adhesive,and the dentin/resin bonding specimens were made：丨in the control group,the single bond2(SB2)was directly treated and bonded；(2)in the10-MDP group,the dentin surface was pretreated with a self-prepared primer containing phosphate monomer10-MDP before u
sing SB2treatment for bonding；③in the CHX group,the dentin surface was pretreated with chlorhexidine(CHX)before bonding with SB2；④in the SBU group,single bond universal(SBU),a MDP-containing universal adhesive,was directly used for bonding.The bonding strength was measured by micro-tensile bond strength(|jl TBS),and the dentin surface treated with self-prepared10-MDP primer and two kinds of dentine adhesives was characterized by X-ray diffraction (XRD)and in situ zymography test to analyze the effect of10-MDP-calcium salt fonnation on the dentin bonding perfonnance.Results The results of micro-tensile bond strength test showed that there was no significant statistical difference between the adhesive specimens treated with different methods after24h water-storage(P>0.1).After6months water-storage,compared with the10-MDP group and the SBU group,the micro-tensile strength test of the control group was significantly reduced(P<0.05),while the micro-tensile strength test of the CHX group did not change significantly(P>0.05).The XRD results showed that the characteristic peaks of10-
基金项目：国家自然科学基金(81970927)；江苏省自然科学基金(BK20191348)；青蓝丁程；江苏高校优势学科建设T程资助项目(2018-87)
作者单位：1南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室，江苏南京(210029)；2南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，江苏南京(210029)；3南京医科大学附属口腔医院口腔修复科，江苏南京(2100
29)
通信作者：陈晨Tel：(025)69593031
E-mail:ccchicy@njmu.edu MDP-calcium salt formation were detected in both the10-MDP group and the SBU group,indicating the formation of10-MDP-calciuni salt.The results of in situ zymography showed that there was no significant difference between the10-MDP group and the SBU group.The fluorescence intensity of the hybrid layers in the control group was significantly higher than that of the10-MDP group and the SBU group,while the fluorescence intensity of the CHX group was lower than that of the10-MDP group and the SBU group.Conclusion The fonnation of10-MDP-calcium
salt
•2•王琦，等.IO-MDP-钙盐形成对牙本质粘接成绩影响的评价
can protect the exposed collagen fibers from contacting MMPs and avoid hydrolysis,thereby enhancing the dentin/resin bonding per-fonnance.
Key words:dentin bonding；MMPs；10-MDP；MMPs inhibitor
树脂与牙本质的粘接都依赖于“混合层（HL）”的形成，它是决定粘接强度的主要因素⑴。在牙科粘接剂体系中掺入功能性单体被发现可以防止HL 层的降解I21,10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氢盐（10-MDP）是一种使用最广泛、最稳定的酸性功能单体，已有研究证明10-MDP可与径基磷灰石建立稳定的化学相互作用并耐水解，从而延长HL的保存时间"T。HL内暴露的胶原纤维水解是HL降解的主要因素之一，而暴露的胶原纤维极易受到人牙本质中内源性基质金属蛋白酶（MMPs）的影响，从而导致混合层水解，降低粘接强度⑴。既然10-MDP与羟基磷灰石能够形成钙盐，而这一化学结合是否有助于保护牙本质胶原纤维抵抗MMPs的降解尚值得研究。当前研究即通过微拉伸粘接强度、原位酶谱及X射线衍射分析评价10-MDP-钙盐的形成对牙本质粘接成绩的影响。
1材料与方法
1.1牙本质/树脂粘接样本制备
经南京医科大学伦理委员会批准，收集20颗新鲜拔除无碉人类第三磨牙，去除牙齿表面的杂质及软组
织。在流水状态下使用低速金刚砂切割机（Isomet1000,Buehler Ltd.,Lake Bluff,IL，美国）垂直于牙体长轴切割出16个3mm厚的和4个1 mm厚的牙本质片，去除表面牙釉质，牙本质片表面依次使用400目和600目碳化硅砂纸湿抛光1min，以制备玷污层。使用牙科显微镜（OMS2350牙科显微镜,Zumax，中国）仔细检查所有的牙本质表面，以确保没有残留的牙釉质或牙髓暴露。然后，将牙本质储存在4T Hanks平衡盐溶液中，用于制备牙本质粘接试件。
本实验所用的含10-MDP的底涂剂参照以下配方制备[6]：10%的10-MDP（DM Healthcare Products，美国）；88.8%的无水乙醇（上海沪试，中国）；0.3%樟脑醞（CQ，阿拉丁，中国）,0.9%的4-二甲基氨基苯甲酸乙酯（4EDMAB，阿拉丁，中国）。所有牙本质表面均用35%磷酸酸蚀剂（Gluma Etch35Gel，德国）酸蚀15s，然后用水彻底冲洗30s，牙本质表面用吸水纸轻拭去除多余水分。然后将16个3mm 厚的牙本质片随机分为4组（n=4），按照表1分组
Stomatology,2021,41(1)：1-5
进行处理"
表1各组牙本质试件的表面处理
Tab.1Surface treatment of dentin specimens
in each group
分组牙本质粘接处理步骤
对照酸蚀+Single bond2
10-MDP酸蚀+10-MDP+Single bond2
CHX酸蚀+CHX(氯己定)+Single bond2
SBU酸蚀+Single bond universal
使用含10-MDP的底涂剂涂布于10-MDP组酸蚀后的牙本质表面20s，并用光固化灯（Elipar™S10,3M ESPE，美国）光固化20s；将CHX（维真园，中国）涂布于CHX组酸蚀后的牙本质表面60s，牙本质表面用吸水纸轻拭去除多余水分。随后每组将各自使用的粘接剂涂布于牙本质表面，光固化20s。然后，将复合树脂（Filtek Z25O,3M ESPE，美国）分两层堆置到涂布粘接剂的牙本质表面上，每层2 mm，牢固压实并光固化40s。将每组的牙本质/树脂粘接样本在37°C的蒸憎水中保存24h和6个月。
1.2微拉伸粘接强度测试
水储24h或6个月后，用低速切割机将每个牙本质粘接的样本垂直牙体长轴切成约1mm"mm 的柱状试件，每个粘接样本中取最靠近中心的4~5根柱状试件，用电子游标卡尺（MNT-150,Meinaite，中国）测量并记录每根试件的横截面积，精确至0.01 mm。将每个柱状试件用氧基丙烯酸粘接剂粘接到微拉伸装置（micro tensile tester,BISCO，美国）的夹具上，并以1mm/min的速度施加拉力，直到发生断裂，记录拉力F（N）。测量结果以MPa表示，是通过将断裂时的作用力F（N）除以单个样品的粘接面积得出的。记录每组24h和6个月水储的微拉伸测试粘接强度（"TBS），并计算平均值和标准差。采用SPSS25.0软件进行双因素方差分析（Two-way ANOVA）,P<0.05为差异有显著性意义。
1.3X射线衍射分析（XRD）
取0.3g轻基磷灰石粉，分为3份，按照表1分组进行处理，反应4h。反应完成后，加入丙酮，3500r/min离心20min，倒出上清液，反复清洗3次，然后将反应残余物放置于37弋恒温箱干燥4h。通过射线衍射仪上进行分析，工作电压为40kV，电
口腔医学2021年1月第41卷第1期•3•
流为200mA，以连续方式进行扫描，扫描20范围为
0.6°-40.0°，速度为0.02°/s，记录实验结果。
1.4原位酶谱分析
按照表1分组对4个1mm厚的牙本质片表面进行处理。将厚度为1mm的流动树脂（Filtek Flow,3M ESPE，美国）堆置到牙本质上并光固化20 s，然后用低速切割机将其垂直于粘接界面切成1 mm厚的薄片，从厚度为1mm的薄片中心区域切取出1mm的柱状试件，暴露出树脂-粘接剂-牙本质界面。
用砂纸将柱状试件磨至厚度为500|xm的样本，然后用氧基丙烯酸粘接剂粘到显微镜载玻片上以备用。使用DQ-明胶（dyequenehed-gelatin）作为MMP底物（EnzChekGelatinase/Collagenase Assay Kit,Thermo Fisher Scientific，美国）进行原位酶谱分析。通过向含有DQ-明胶的管中加入1.0mL纯水制备成1.0mg/mL荧光素标记的明胶溶液，将其储存在-20T直至使用。用1：1的PBS缓冲液以体积比1：8稀释明胶原液，避光保存。用移液将50“L明胶混合物置于载玻片上，使明胶混合液充分浸泡试件，并盖上盖玻片。将载玻片避光保存并在37T恒温箱内孵育24h使用激光共聚焦显微镜（CLSM）（Zeiss LSM880with NLO&Airyscan，德国）进行分析.评估牙本质内源性明胶分解酶的活性。
2结果
2.1微拉伸测试
4组试件分别在37°C水浴锅中储存24 h和6个月后的微拉伸强度测试值，见表2。
表2在不同水储情况下,4组“TBS结果
Tab.2“TBS results of4groups under different water
storage conditions MPa 分组24h6个月
对照40.70±3.44Aa29.31±4.98Bac
10-MDP43.00±4.48Aa36.11±4.61Bb
CHX37.88±5.21Aa33.46±5.03b,m
SBU42.51±2.92Aa36.77±2.16bi>
上标大写（小写）字母表示表格中数值的横向（纵向）比较.相同上标大写（小写）字母表明两组ptTBS数据没有统计学差异（P>0.05）使用HSD检验法和最小显著性法统计分析发现，水储24h后，不同处理方式的4组微拉伸粘接强度均无统计学差异（P均大于0.05），然而水储6个月后，对照组J0-MDP组、SBU组的微拉伸粘接强度相对于24h者均显著降低（P<0.05），其中对照组最低;CHX组则在水储6个月后维持了微拉伸粘接强度的稳定（P=0.352）。
2.2XRD
如图1所示：对照组,10-MDP组和SBU组反应残留物的XRD图谱，10-MDP组和SBU组分别在20 =4.16。，7.34。和20=4.66。，7.02。（箭头所示）有两个特征性的峰，表明MDP-钙盐的形成7：。
图1XRD结果
Fig.I Results of XRD
2.3原位酶谱
各组样本经过24h孵育后，原位酶谱结果如图2显示，对照组中在混合层以及牙本质小管中可以看出强烈的绿荧光标记，这表明对照组中的明胶水解较强烈；与对照组相比,10-MDP组与SBU组荧光强度明显减弱，表明这两组明胶有被水解，但水解程度低于对照组，而10-MDP组与SBU组间的荧光程度没有明显区别；CHX组的荧光强度也较对照组低。
3讨论
微拉伸强度测试是表征牙本质粘接强度的有效方法之一⑻。根据微拉伸结果（表2）显示，在24h 的即刻组中，每组的微拉伸强度都无统计学差异（P >0.1），而在6个月的水储后,10-MDP组、SBU组和对照组的微拉伸强度出现了变化，每组的微拉伸强度都有所降低，但在6个月中的10-MDP组与SBU 组微拉伸强度显著高于对照组（P<0.05），表明10-MDP对牙本质/数值粘接界面的耐久性有着积极的作
用⑷，有利于粘接界面的保存。此外.原位酶谱（图2）显示，对照组荧光强度显著高于10-MDP组与SBU组，这与微拉伸结果一致。MMPs的水解作用只有在被激活后才能发挥出来，MMPs极易被激活如酸蚀过程中⑼，激活后可降解粘接界面混合层内暴露的胶原纤维，导致混合层的水解，
从而降低粘
• 4 •1-琦，等.10-MI)P ・钙盐形成对牙本质粘接成绩影响的评价
图2原位酶谱结果
Fig.2 Results of in situ zymography
R y ；
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< # • * ：D
R
HL
D
F 「 f
* ■
R
HL D
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*美国女明星
R ：树脂;D ：牙本质;HL ：混合层
接强度■。原位酶谱显示:10-MDP 组与SBU 组荧
光强度无明显区别，结合XRD 观察到的结果如图1
所示,10-MDP 组与SBU 组均检测到10-MDP-钙盐 的特征性峰，而对照组并未观察到这一现象，表明在
10-MDP 组与SBU 组均有10-MDP-钙盐的形成.从
而降低MMPs 的活性，进而提高粘接强度。10-MDP
两端的化学结构分别为磷酸基团“ 一OP (()H ) 2 ”与双 键“C=C ”，“一OP(OH )2”可以与钙离子形成疏水 的纳米层状结构增强牙本质粘接的耐久性，另一端
的“C =C ”双键可以与树脂水门汀基质中的“C =C ” 双键发生加聚反应，从而延长混合层的保存时
间101 0 10-MDP 会与牙本质中的轻基磷灰石吸附发 生化学作用.10-MDP 的吸附引起羟基磷灰石表面 溶解，随后沉积形成难溶的10-MDP -钙盐".且10-
MDP-钙盐溶解度越低,10-MDP 对轻基磷灰石的吸
附力越强Q ，生成厚约4 nm 的纳米交互层结构紧 密吸附于羟基磷灰石表面，可为粘接剂提供更多的
化学结合位点，从而延长牙本质-树脂粘接界面的
保存时间⑴)。并且10-MDP -钙盐对牙本质胶原纤
维有很强的化学吸附作用，能够与胶原纤维在分子
稳重的网名水平上发生稳定的相互作用，这有助于保护牙本质
暴露的胶原纤维，抵抗MMPs 的降解，维持树脂-牙
本质粘接界面的完整性* ；此外,10-MDP 有一个长
脂肪链，长链使10-MDP 与水分子保持一定的距离， 同时促进了胶原的疏水作用，这也有助于保护牙
本质胶原纤维抵抗MMPs 的水解。
CHX 是一种有效和非特异性的MMPs 抑制剂，
在微拉伸结果中显示,CHX 组在24 h 和6个月时的 粘接强度无明显区别(P>0.05)，这与原位酶谱结果
一致，如图1所示，在CHX 组表现为最低的荧光强 度，这与先前的研究一致心。Favetti 等M 提出, CHX 可以在6个月内保持粘接强度的耐久性。与 CIIX 组比较,10-MDP 组和SBU 组微拉伸强度均有 所降低(P<0.05)，这表明虽然10-MDP-钙盐的形成
对内源性牙本质MMPs 的活性被表现为抑制，但其
任意依恋结局抑制能力并不强于CHX
此外，在微拉伸的结果中,10-MDP 组与SBU 组
从24 h 到6个月，粘接强度表现为明显的降低(P< 0.05)0这与一些研究结果不一致,8-'9 o 这可能是 因
为将牙本质粘接样本存储在水环境中时，粘接剂
会吸收水分，使其内部的亲水性和疏水性成分发生
相分离，会增加水解作用的敏感性.从而使树脂-牙 本质界面水解，导致微拉伸强度的下降。
4结论
酸性功能单体10-MDP 之所以能发挥作用，离
口腔医学2021年1月第41卷第1期•5•
不开与羟基磷灰石之间相互作用形成的10-MDP-钙盐，通过10-MDP-钙盐保护暴露的胶原纤维不接触到MMPs而免于水解，这对延长树脂-牙本质粘接界面的保存时间有显著意义。
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(修回日期：2020-08-31)
(本文编辑：
田慧)
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