1.目的
2.范围
适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。
3.职责
质量检验人员负责执行此规程。
4.依据标准及相关文件
2010 版《中华人民共和国药典第二部》附录Ⅺ J 微生物限度检查法
GB/T19973.1-2005 《医疗器械的灭菌 - 五十六个民族的节日微生物学方法 - 第一部分 产品中微生
物数量的估计》
GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》
5.试验产品
6.注意事项
6.1 | 本操作应在环境洁净度 | 10000 级下的局部洁净度 100 | 级的无菌操作台内 |
进行。操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。 | |||
6.2 | 洗葡萄的方法15min 后方可 | ||
进行实验操作。
6.3
膜在过滤前后的完整性。
7.器材与试剂
7.1 器材
35℃恒温培养箱、 23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液
器、接种环
7.2 稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。
pH 7.0 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液
0.9%无菌氯化钠溶液。
营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。
8.计数方法的验证试验
当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
8.1 菌种
培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代，从菌种保藏中心获得的
冷冻干燥菌种为 0 代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学
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特性。 | ||||||
金黄葡萄球菌 Staphylococcus aureus | 〔 CMCC B | 26 003 〕 | ||||
大肠埃希菌 Escherichia coli | 〔 CMCC B 11 102 〕 | |||||
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis | 〔CMCC B 63 501 〕 | |||||
白念珠菌 Candida albicans | 〔 CMCC F 98 001 〕 | |||||
黑曲霉 Aspergillus niger | 〔 CMCC F | 98 003 〕 | ||||
8.2 | 菌液制备 | |||||
接种金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养 | ||||||
基中或营养琼脂培养基上， | 30-35 ℃培养 18-24 小时，接种白念珠菌的新 | |||||
鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上 | 23-28 ℃培养 24-48 | |||||
小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml | 含菌数为 50-100cfu | |||||
的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上 | 23-28 ℃ | |||||
培养 5-7 天，加入 3-5ml 含 0.05%（ mol/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯 | ||||||
化钠溶液 ,, | 刘亦菲陈金飞 | |||||
0.05%（ mol/ml ）聚山梨酯 | 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml | 含菌数为 | ||||
50-100cfu 的孢子悬液。 | ||||||
注：菌液制备后若在室温下放置，应在 | 2 小时内使用，若保存在 | 2-8 ℃，可在 | ||||
24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 | 2-8 | |||||
8.3 | 供试液的制备 | |||||
在洁净工作台内，将样品分别放入配制好的 | pH7.0 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓 | |||||
冲液中，充分震荡，作为试验液。 | ||||||
8.4 | 培养条件 | |||||
细菌 30-35 ℃培养杨千嬅 结婚 3 天； | ||||||
霉菌及酵母菌 23-28 ℃培养 | 5 天； | |||||
8.5 | 验证方法 | |||||
8.5.1 | 验证试验至少应进行 | 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验 | ||||
的回收率
★试验组菌回收率 =（A-C） /B
★稀释剂对照组菌回收率 =D/B
8.5.2 薄膜过滤法
依据 ISO11737-1 所述，膜过滤法尤其适用于微生物浓度较低的悬液。因此本验证首选薄膜过滤法。
A.试验组
①100ml 样品供试液
②100ml 稀释的菌悬液，包括： 1ml 含 50-100cfu 的菌悬液和 99mlPH7.0
无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；
B.菌液组
①100ml 稀释的菌悬液，包括立春的优美句子 :1ml 含 50-100cfu 的菌悬液和 99mlPH7.0
无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液 ;
上坡辅助C.供试品对照组
① 100ml 样品供试液
②冲洗液 :100ml 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液 PH7.0
D.稀释剂对照组
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