1.目的
验证产品初始污染菌数的试验方法。
2.范围
适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。
3.职责
质量检验人员负责执行此规程。
4.依据标准及相关文件
2010 版《中华人民共和国药典第二部》附录Ⅺ    J    微生物限度检查法
GB/T19973.1-2005 《医疗器械的灭菌    - 五十六个民族的节日微生物学方法 - 第一部分    产品中微生
物数量的估计》
GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》
5.试验产品
6.注意事项
6.1
本操作应在环境洁净度
10000 级下的局部洁净度  100
级的无菌操作台内
进行。操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。
6.2
洗葡萄的方法15min 后方可
进行实验操作。
6.3
膜在过滤前后的完整性。
7.器材与试剂
7.1    器材
35℃恒温培养箱、  23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液
器、接种环
7.2    稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。
pH 7.0    无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液
0.9%无菌氯化钠溶液。
7.3    培养基
营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。
8.计数方法的验证试验
当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
8.1    菌种
培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过    5 代，从菌种保藏中心获得的
冷冻干燥菌种为    0 代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学

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特性。
金黄葡萄球菌  Staphylococcus aureus
〔 CMCC B
26 003 〕
大肠埃希菌  Escherichia coli
〔 CMCC B  11 102 〕
枯草芽孢杆菌  Bacillus subtilis
〔CMCC B  63 501 〕
白念珠菌  Candida albicans
〔 CMCC F  98 001 〕
黑曲霉 Aspergillus niger
〔 CMCC F
98 003 〕
8.2
菌液制备
接种金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养
基中或营养琼脂培养基上，
30-35 ℃培养 18-24 小时，接种白念珠菌的新
鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上
23-28 ℃培养 24-48
小时。上述培养物用  0.9%无菌氯化钠溶液制成每  1ml
含菌数为  50-100cfu
的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上
23-28 ℃
培养 5-7 天，加入  3-5ml  含 0.05%（ mol/ml ）聚山梨酯  80 的 0.9%无菌氯
化钠溶液 ,,
刘亦菲陈金飞
0.05%（ mol/ml ）聚山梨酯
80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每  1ml
含菌数为
50-100cfu  的孢子悬液。
注：菌液制备后若在室温下放置，应在
2 小时内使用，若保存在
2-8 ℃，可在
24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在
2-8
8.3
供试液的制备
在洁净工作台内，将样品分别放入配制好的
pH7.0 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓
冲液中，充分震荡，作为试验液。
8.4
培养条件
细菌 30-35 ℃培养杨千嬅 结婚 3 天；
霉菌及酵母菌  23-28 ℃培养
5 天；
8.5
验证方法
8.5.1
验证试验至少应进行
3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验
的回收率
★试验组菌回收率    =（A-C） /B
★稀释剂对照组菌回收率    =D/B
8.5.2    薄膜过滤法
依据 ISO11737-1 所述，膜过滤法尤其适用于微生物浓度较低的悬液。因此本验证首选薄膜过滤法。
A.试验组
①100ml 样品供试液
②100ml 稀释的菌悬液，包括：  1ml 含 50-100cfu  的菌悬液和  99mlPH7.0
无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；
B.菌液组
①100ml 稀释的菌悬液，包括立春的优美句子  :1ml 含 50-100cfu  的菌悬液和  99mlPH7.0
无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液    ;
上坡辅助
C.供试品对照组
① 100ml 样品供试液
②冲洗液 :100ml 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液    PH7.0
D.稀释剂对照组

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