大肠杆菌的检测技术简介
摘要：本文综述了大肠杆菌的生物学特性及研究现状，介绍了大肠杆菌的传统检测法及最新的快速检测方法，为大肠杆菌的快检技术的研究提供参考。
大肠细菌(escherichia li)为埃希氏菌属(Escheriehia)代表菌，由德国细菌学家Theodo:Escherich1885年首次发现而得名。大肠杆菌是人和动物肠道中的正常栖居菌，主要寄生在大肠内。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。但若进入胆囊、膀肤等处可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀肤炎及腹泻等。一些特殊血清型的大肠杆菌(如大肠杆菌O157:H7)对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，称为致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。
传统的微生物检测方法包括滤膜法，多管发酵法等，虽然结果比较准确，但是也存在培养时间长，缺乏特异性及操作复杂的缺点。因此，建立快速且灵敏度较高的方法，成为环境保护、传染病检测、监查及公共卫生监督领域中最重要的研究对象之一。
1 大肠杆菌的生物学特性
大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，长约2*10-3cm，宽约0.5*10-3cm，体积约为0.6-0.7*10-6cm周身鞭毛大约每个菌细胞有4一6根鞭毛能运动无芽孢。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、钱盐、葡萄糖的普通培养基上生长大肠杆菌的卫生标准大肠杆菌大量存在于人及其他恒温动物体内的肠道内，常随人及动物粪便一块排出，广泛传播于自然环境中，对水源造成污染。若在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久，这些特性使他们可以作为一个理想的生物测试环境样品的粪便污染指示物，因此，大肠杆菌的检测己成为环境微生物学中重要的检测项目之一。目前，世界各国及国际组织都将大肠菌数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，所有用于饮用的水中大肠杆菌或耐热大肠菌在任意 100mL水样中不得检出;现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠菌为 cfu/ml;中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌及粪大肠菌每100mL水样中不得检出。
2大肠杆菌检测的研究现状
检测大肠杆菌的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各种样品，但操作复杂，检测时间较长;滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发酵法更为简单。但是这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。目前，国内外研究人员已经发展了一些新方法进行大肠杆菌的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫分析法、电化学方法、荧光法等。良好。最适生长温度为37℃，在42℃并4℃条件下也可生长，有些实验室菌株在高达49℃下仍能繁殖。大肠杆菌兼性厌氧，其最适生长的pH值范围为6.8一8.0。在酸性发酵的厌氧条件下，大肠杆菌可以产生乳酸，琥珀酸，乙醇，乙酸和二氧化碳等。
3检测大肠杆菌的传统方法
3.1多管发酵法
食品中大肠茵数常以每100ml（g)检测样品内大肠菌最近似数（MPN）来表示。大肠菌的测定，一般应包括发酵试验(在单料或双料乳糖胆盐发酵管内进行)、分离培养试验(
利用伊红美蓝平皿分离)、复发酵试验(在乳糖发酵管中进行)、革兰氏染、芽抱染、显微镜观察等试验操作。
大肠杆菌多管发酵法是指多管发酵法大肠菌阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h，能产生β一葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠杆菌的方法。多管发酵法是对样品中活菌浓度的一种估计值。
当混勾的样品通过一系列稀释和等量分配成为小样品时，有些小样品中最后喊样品量少，以至其中不再含有需检验的细菌。在一定的小样品中存在或不存在细菌，可被用来对原样品的菌数作统计学估计。多管发酵法就是这样一种将样品“多次(管)稀释至无菌”的计数方法。在此方法中，将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或巧支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。
多管发酵法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。比如水、乳制品及其他食品中大肠菌的计数测定。在对一个产气肠杆菌纯培养物作计数时，应采用选择性平板计
数法而不要用多管发酵法。如果待检测的样品是以其他细菌为主的河水，就应选用多管发酵法。
食物上细菌的分布有可能是完全均匀的，也有可能存在于固态食物的表面上，或者有可能分布在食物的特定的污染点，或是在全部食物中随机分布的定位的污染点上。MPN表中所列的值是假定所检验的细菌在样品或检样稀释液中呈均匀分布而计算出来的。而食物中的脂肪和不溶性食物颗粒妨碍了均一性，由于这个原因，由食物样品中所得到的MPN值，比之由水样中所得到MPN值的精确度和可重复性就要差一些。
3.2滤膜法
针对大肠菌的滤膜法是指用孔径为 0.45pm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上 37OC培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中大肠菌的方法。采用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在品红硫酸钠培养基上进行培养，因大肠菌可以发酵乳糖，在滤膜上出现紫红具有金属光泽的菌落。直接计数滤膜上生长的典型大肠菌茵落，可计算出每升水样中含大肠菌数。如果有必要，对可疑菌落应进行涂片染镜检，并再接种乳糖
发酵管进一步鉴定。
大肠杆菌滤膜法则是指用滤膜法检测水样后，将大肠菌阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生p一葡萄糖醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠杆菌的方法.
滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵技术更快地获得肯定的结果。不过在检验浑浊度高、非大肠杆菌类的细菌密度大的水样时，有其局限性。
多管发酵法和滤膜法的结果作统计学比较，可显示后者较为精密。虽然这两种技术所得到的数据都提供了基本相同的样品质量情报，但检验结果的数值不同。在做水源的检验时，可以预期约有80%的滤膜实验的数据落在多管发酵实验数据95%的置信界限内
4检测大肠杆菌的新方法
4.1酶底物法
在国家标准<GBT5750.12一2006生活饮用水标准检验方法>中介绍了大肠菌和大肠杆菌
酶底物法。大肠菌酶底物法是指在选择性培养基上能产生β一半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)的细菌组，该细菌组能分解原底物释放出原体使培养基呈现颜变化，以此技术来检测水中总大肠菌的方法。大肠杆菌酶底物法是指在选择性培养基上能产生p一半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)分解原底物释放出原体使培养基呈现颜变化，并能产生压葡萄糖醛酸酶(β一ghicuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
酶底物法之所以可以入选国家标准，是由于根据相关研究报道，几乎所有的大肠菌都有β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase)活性，94%一97%的大肠杆菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶(β-D-一glucuronidase)活性，而且水体和食品中都缺少这两种酶。因此，基于这两种酶的水体和食品中大肠菌和大肠杆菌的检测方法得到了迅速的发展。最近报道的一种安培生物传感器应用对氨基酚β-D-毗喃半乳糖苷（PAPG)作为底物，能够在60一7min内检测1000 cfu/ml的大肠杆菌，采用预培养步骤可将灵敏度提高约一百倍。
4.2聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术(PCR，Polymerase Chain Reaction)是利用从耐热菌中分离的DNA聚合酶，加入适量寡聚核普酸引物，以四种脱氧核普酸材料模拟天然DNA复制过程，在实验室条件下特异性扩增DNA(或RNA)片段的一种新技术。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:1.模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便与引物结合，为下轮反应作准备;2.模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;3.引物的延伸:DNA模板一引物结合物在几qDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2一4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术经过近20年的发展已经相当标准和成熟，与电化学传感器、酶联免疫分析以及表面等离子共振传感器等检测方法结合已被广泛应用于细菌的检测成为微生物检测技术中常见而重要的最基础的分析手段之一。其中，应用于大肠杆菌快速检测的PCR技术也到的了长足的发展。Fricke:等建立了基于PCR的大肠杆菌检测方法，可在24h内完成99种不同的
环境水样检测，检测结果与标准方法100%吻合。Fortin等将套式PCR技术和荧光探针相结合，可检测出牛奶和果汁中大于100c几如L的大肠杆菌，如果对细菌进行增菌处理，则可在6小时内检测到低至lefi刀mL的大肠杆菌。但是，PCR技术检测大肠杆菌有三点局限:一是难以精确定量;二是由于灵敏度高，操作不慎易交叉污染，产生假阳性，三是操作复杂，仪器昂贵，不利与大规模应用。
4.3免疫检测技术
免疫检测技术是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，分为放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、酶免疫分析、酶联免疫分析及电化学免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。免疫检测技术具有许多优点:第一，高选择性。抗体的特异性很高，在免疫分析中一般样品不需要预处理，这一点决定了分析结果的可靠性，同时可以省略预分离的过程。第二，高亲和性。保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，这也是达到高灵敏分析的基础。事实上，抗体与抗原复合物的稳定常数一般为109，有些可达1014一10生活中最常见纳米技术15，有较高的稳定性。第三，高灵敏性。抗体与其复合物间应有较大的信号反差，试剂空白低，从而结果准确而灵敏。免疫检测技术还具有
检测时间短、样品通量大、检测成本低等优势。因此，在水体和食品中大肠杆菌的检测领域得到了诸多应用.
4.4化学发光法
化学发光法是利用物质在进行化学反应过程中伴随的光辐射现象的一种化学分析方法。化学发光法在培养时间足够长的情况下可以检测到非常低的细浓度，最低可以准确检测到样品中的几个大肠杆菌。由于对细菌的渗透可以减胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递，科学工作者经常利用此来提高检测号。同样，荧光分析法也可以在充足的培养时间下检测到样品中几个大肠杆菌。例如Mathew等发展了一种化学发光检测大肠杆菌的方法。大肠杆菌在特定的培养过程中能够产生半乳糖普酶，此酶能与Lumi- Gal⑧530发生反应产生化学发光，发光强度与大肠杆菌在1x103-1xl06cfu/mL的范围内成线性关系。Van等使用了改进的荧光物质和化学发光物质作为p一葡萄糖普酸酶的底物，提高了底物与细胞之间的输送速度，显著改善了细菌的检测灵敏度，缩短了检测时间。