谭何新+肖玲+周正张磊+陈万生
[摘要]以青蒿素为基础的联合用药是疟疾特别是恶性疟现有的首选、最佳疗法，青蒿素类药物需求巨大。青蒿素原料药依旧主要依赖于从药用植物黄花蒿（中药青蒿）提取、分离、纯化，但其在黄花蒿中的含量较低，且含量变异大。黄花蒿分泌型腺毛是合成、分泌、积累及储存青蒿素的场所，腺毛的正常发育直接关系到青蒿素的产量。提高青蒿素产量、降低生产成本有重大意义，也是当前国际研究热点。该文介绍了青蒿素体内生物合成的分子机制和代谢调控，以及青蒿素合成器腺毛的研究进展，这些将为开拓新的方法来提高植物来源青蒿素的产量提供帮助。
[关键词]青蒿素； 黄花蒿； 腺毛； 分子机制； 遗传调控
疟疾流行于97个国家和地区，威胁着32亿人口的健康。据世界卫生组织最新统计，2015年约有214亿人感染疟疾，并有约438万人死于疟疾[1]。以青蒿素为基础的联合用药（artemisininbased combination therapies，ACTs）是疟疾特别是恶性疟现有的首选、
最佳方法[12]。屠呦呦先生也因其在青蒿素的发现及青蒿素在疟疾方面的巨大贡献获得了2015年的诺贝尔生理学或医学奖。青蒿素是一种含过氧桥基团结构的倍半萜内酯类化合物，其每年需求量巨大，但是供应量却相对紧缺[3]，这直接导致了ACTs制剂成本的增加。此外，青蒿素及其衍生物的药理作用还表现在抗肿瘤、抗寄生虫、抗纤维化、抗心律失常、免疫等多方面[45]，随着青蒿素及其衍生物应用的开发，其需求将进一步增大。
青蒿素来源于菊科蒿属药用植物黄花蒿Artemisia annua L，其干燥地上部分被称为中药青蒿[67]。黄花蒿是青蒿素的唯一天然来源，但是其含量却相对较低，只占干重的01%～08%[89]。如何提高青蒿素产量，降低生产成本，是当前國内外黄花蒿育种研究的热点。已有许多科学家正在尝试用不同的方法来增加青蒿素的产量，合成生物学及化学合成在青蒿素生物半合成上取得了较大进展[10]。由于酵母无法像黄花蒿腺毛一样提供青蒿素合成所需的特殊油性氧化环境，所以目前还无法实现青蒿素的体外生物全合成，因此目前青蒿素的市场供应仍然依赖于植物提取[10]。未来青蒿素的市场可能是植物来源和生物半合成的协调平衡[11]。
为了提高青蒿素产量，在青蒿素生物合成途径代谢酶的调控方面已有较多研究。在黄花蒿
中过表达青蒿素生物合成的关键酶基因或抑制与青蒿素生物合成竞争相同底物的酶基因的表达，通过转录因子或植物激素来直接或间接地提高青蒿素的含量[1213]。这些方法都在一定程度上提高了黄花蒿中青蒿素的含量[12]，如果要进一步提高青蒿素的产量，还需开发新的方法。前期研究表明，青蒿素在黄花蒿地上部分表面的一种突起结构——腺毛中合成、积累和分泌[1415]。作为青蒿素生物合成的“化学工厂”，调控腺毛发育有可能实现青蒿素含量大幅提高。
1青蒿素合成于黄花蒿腺毛
腺毛是毛状体（trichome）的一种，毛状体是许多植物叶片和其他器官表面的小突起结构，它们的最大特征就是能够合成，储存，有时候还能分泌大量特定的代谢产物[16]，包含多种类型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和类黄酮。许多毛状体产生的化合物具有重要的医药，香料，食品添加剂，天然杀虫剂等商业价值。近年来将腺毛开发成“化学工厂”来生产高价值的植物产物引起了植物生物技术专家的关注[17]。
腺毛通过表皮细胞分化而形成，以各种各样的形态结构存在于不同植物表面[18]。腺毛形态的多样性不仅因物种不同而异，同一物种、同一株植物中腺毛的形态也会表现出多样性。
通常来说，腺毛可以根据形态和功能被分为分泌型腺毛和非分泌型腺毛两大类。分泌型腺毛具有多个细胞，能合成、分泌和贮存多种植物次生代谢产物，并广泛分布在唇形科植物如薄荷[19]，茄科植物如番茄[20]，菊科植物如黄花蒿[18]和科植物如[21]中。非分泌型腺毛基本为单细胞，主要作为物理防御器官。有些也能合成次生代谢产物，如三萜类物质[22]。非分泌型腺毛广泛分布在锦葵科植物如棉花[23]和十字花科植物如拟南芥[24]中。
腺毛是植物对抗外界胁迫的第一道屏障，可以保护植物本身免受外界昆虫、细菌、紫外辐射以及干旱等的影响[25]。特别是分泌型腺毛，可以通过释放一些对昆虫和动物有害的化学物质（通常为一些次生代谢产物），从而阻挡它们对植物体的进一步侵害。此外，青蒿素和一些其他生物活性物质对植物本身有很高的毒性[26]，所以将其扣留在或者分泌出合成部位就显得非常重要。腺毛的表皮下空间很可能就是黄花蒿扣留青蒿素和其他植物毒性物质的场所[14]。
与自然界中腺毛的分类相同，黄花蒿中腺毛也可以分为2类，即分泌型腺毛（AaGSTs）（图1绿箭头）和非分泌型腺毛（又称T型腺毛，AaTNGs）（图1蓝箭头）。它们都起
源于表皮细胞[14，27]。其中AaGSTs 由2列5对、10个细胞组成，包含2个基细胞（basal cells，Ba），2个柄细胞（stalk cells，St），4个下顶细胞（subapical cells，Suc）和2个顶细胞（apical cells，Ac），以及1个皮下腔空间（subcuticular space，SS）（图1）。2个顶细胞和4个下顶细胞又称为分泌细胞[14]。AaTNGs 由5个纤维状细胞组成，头部还有1个特别细长的细胞，最终形成一个类似于英文字母大写“T”的结构[28]。
叶细胞分化成腺毛细胞起始于最早的叶原基时期，当10个细胞形成后，6个分泌细胞的角质层从细胞壁分离形成1个2列的囊腔，并最终裂开释放内含物[14]。在整个发育时期，腺毛细胞都含有很少的液泡，分泌细胞含有较多的内质网，每一对细胞的质体都是不一样的[14]。在成熟期，顶细胞含有前质体和白体，只有少量的类囊体。而下顶细胞含有大量的叶绿体，不具有淀粉粒。基细胞有前质体或者白体，柄细胞有叶绿体[14]。
Duke等通过5 s的氯仿浸泡，可以提取黄花蒿叶片中97%的青蒿素和全部的青蒿烯，同时发现除了分泌型腺毛的皮下腔空间（SS）塌陷了，叶片表面并没有其他破坏，因此认为青蒿素和青蒿烯全部储存在分泌型腺毛的皮下腔空间[15]。而且青蒿素只存在于含有腺毛的种中[15]，因此腺毛也被认为是青蒿素体内合成、分泌、积累及储存的场所，但是青蒿素如何在
腺毛内合成不清楚。由于下顶细胞与顶细胞的结构及内含物不同，关于青蒿素是只在顶细胞中合成，还是在6个分泌细胞中都合成一直存在较大争议。Olsson等[17]因在4个下顶细胞中没有检测到青蒿素生物合成关键基因ADS，CYP71AV1和DBR2的表达，认为下顶细胞不能合成青蒿素，可能具有与顶细胞不同的功能，比如合成单萜类化合物。2012年Olofsson等[29]通过激光显微切割和qRTPCR提出顶细胞和下顶细胞都能合成青蒿素。腺毛转录组数据分析显示下顶细胞中存在所有青蒿素生物合成途径基因的表达[22]。因此，青蒿素是否由分泌型腺毛的下顶细胞和顶细胞共同产生，还需要细胞化学的研究证据来进一步确证。此外，黄花蒿腺毛转录组数据分析还发现非分泌型腺毛中也存在倍半萜和三萜类生物合成特异性基因的表达，这暗示非分泌型腺毛——T型腺毛，也可能具有与分泌型腺毛相似的功能。
2青蒿素生物合成途径
青蒿素的生物合成途径属于类异戊二烯代谢合成途径，起源于异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。
高等植物中，这种5C骨架的化合物有2条独立的生物合成途径，分别为位于胞质的甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径和位于质体的甲基赤藓醇4磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径（图2）。文献报道已经确定MVA途径和MEP途径对最后生成青蒿素的贡献度是不同的[30]。法呢基焦磷酸（famesyi diphosphate，FPP）的形成是青蒿素生物合成的第一个特异性步骤，2010年Schramek等[30]通过13CO2 同位素标记证明，FPP由2份来源于MVA途径的异戊二烯和1份来源于MEP途径的异戊二烯形成（图2 不同粗细的线条示不同贡献），因此MVA途径在青蒿素生物合成中起主要作用。
以FPP為分界线，FPP之前的步骤被认为是青蒿素生物合成的上游步骤，FPP之后的步骤被认为是青蒿素生物合成的下游步骤。青蒿素上游合成途径已经比较清楚，且有公认的酶及催化步骤[3132]，但下游步骤仍存有争议。青蒿素生物合成的上游及下游路径由图2所示，黑字体为青蒿素合成代谢路径中的化合物，蓝字体所示为参与这一过程的
基因。青蒿素由MVA途径和MEP途径提供IPP，经催化后形成FPP。FPP经紫穗槐二烯合成酶（amorpha4，11diene synthase，ADS）催化生成紫穗槐二烯[33]。紫穗槐二烯经过三步由细胞素P450单氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）催化
的反应，分别形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸[3436]。其中青蒿醇可以被催化形成二氢青蒿醇[37]。青蒿醛可以被青蒿醛双键还原酶[artemisinic aldehyde delta11（13） reductase，DBR2]催化形成二氢青蒿醛[37]。二氢青蒿醛可以被醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）[38]催化形成青蒿酸的直接前体二氢青蒿酸，也可以被二氢青蒿醛还原酶（dihydroartemisinic aldehyde reductase，RED1）催化形成上一步的产物二氢青蒿醇[39]。二氢青蒿醇可以被CYP71AV1和ALDH1催化形成二氢青蒿醛，最后经二氢青蒿酸形成青蒿素。
青蒿素合成下游途径还存在一些争议，AlejosGonzalez 等[40]2011年提出青蒿酸可转化为青蒿素B和青蒿烯，进而形成青蒿素。但是通过青蒿酸和二氢青蒿酸前体饲喂实验证明二氢青蒿酸才是青蒿素的直接前体[37]，青蒿素B和青蒿素可能是青蒿素生物合成途径上的2个不同分支的终产物[34]。在释喂实验中没有提及青蒿烯，可能由于青蒿素B和青蒿烯不稳定，不易检测到。因此青蒿酸是否能通过青蒿烯进而转化成青蒿素还未知。此外，二氢青蒿酸与青蒿素之间是否真的仅需要腺毛提供的特殊油性环境加上光照条件就能顺利转化，是否存在未知的氧化步骤和酶也是未知的。青蒿素下游合成途径在青蒿素生物合成中具有十分重要的作用，正确解析青蒿素生物合成下游途径对于有效开展代谢工程，进而提高青
蒿素含量意义重大。腺毛包含了青蒿素生物合成所需要的全部因素，对腺毛进行调控可以避开青蒿素生物合成途径上存在的暗箱，从宏观上调控青蒿素的生物合成。
3青蒿素含量的代谢调控
目前针对于青蒿素的代谢调控研究策略主要分为3大类。一是过表达青蒿素合成路径中的关键酶基因或阻断青蒿素合成竞争性支路上的关键酶基因；二是通过转录因子调控青蒿素生物合成途径；三是通过植物激素等间接调控青蒿素的合成。
31生物合成途径关键酶基因调控
311通过单基因的过表达已经进行单基因过表达的青蒿素生物合成途经基因有HMGR，FPS，DXR，DBR2，ALDH1，ADS，这些基因在青蒿素的生物合成途径上的位置显示（图2）。HMGR是3羟基3甲基戊二酰辅酶A合成酶，能够将HMGCoA分流到IPP途径来，从而促进青蒿素的合成。Aquil等[4142]在2009年将长春花中的HMGR基因过表达在青蒿中后，能将青蒿素的产量提高225%～389%。此外，HMGR也能促进青蒿酸的合成，酵母表达体系中，3个拷贝的HMGR基因比单拷贝的更能提高青蒿酸的产量[10，43]。FPS是法呢
疟疾的青蒿素是用什么提炼的基焦磷酸合成酶，能够将牻牛儿基二磷酸（GPP）转化成法呢基焦磷酸（FPP）。FPP是一个重要的分支点，也被认为是青蒿素合成下游途径的起点。过表达木本棉FPS 基因可以提高青蒿素产量到2～3倍[44]。过表达黄花蒿内源FPS 基因也能将青蒿素含量提高到2～25倍。但是转入2个拷贝的FPS 基因反而会降低转基因材料中青蒿素的产量[4546]。DXR基因是1脱氧D木酮糖5磷酸还原异构酶[47]，是质体中合成IPP的MEP途径第二步（图2），DXR基因过表达能将青蒿素的产量提高到121～235倍[48]。此外，膦胺霉素能够阻断DXR催化的这一步反应，即阻断DXP转化成MEP[49]，100 μmol·L-1的膦胺霉素处理14 d，能将青蒿素的产量降低25%[50]。ADS是紫穗槐4，11二烯合成酶，能够催化青蒿素合成下游途径的起始步骤（图2），将FPP转化成紫穗槐4，11二烯[5152]。而且通过对启动子的研究发现ADS基因特异地表达在腺毛中[5354]，而腺毛是青蒿素产生和储存的地方，因此ADS基因是调控青蒿素合成的重要靶标。将青蒿酸喷涂到黄花蒿上可使ADS基因的表达降低10倍，说明在青蒿素的合成、积累中存在负反馈抑制[55]。ADS基因的过表达，可将青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的含量分别提高82%，65%和59%[56]，但是ADS的直接产物紫穗槐4，11二烯并没有明显增多，应该是快速被下游反应消耗了[51]。DBR2是青蒿醛Δ11（13）还原酶，能够将青蒿醛还原成二氢青蒿醛，在DBR2过表达的转基因植株中，青蒿
素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的283倍[57]。ALDH1是乙醛脱氢酶，能够催化青蒿醛转化成青蒿酸。黄花蒿内源的ALDH1基因过表达可将青蒿素含量最高提高到干重的256 mg·g-1，是非转化对照（8 mg·g-1干重）的32倍[58]。
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