第25卷 第7期  2016年7月
中国普通外科杂志
Chinese Journal of General Surgery
Vol.25　No.7Jul.  2016
抑癌基因Merlin 与干细胞标记物Nanog 在肝细胞癌中表达的关系及意义
欧阳锡武1，冯铁诚1，张赛2，陶一明1，王志明1
（中南大学湘雅医院  1. 肝脏外科  2. 医学科学研究中心，湖南 长沙410008）
摘  要
目的：探讨肝细胞癌（HCC）抑癌基因失活与肝癌干细胞（LCSC）的关系及其临床意义。
方法：用免疫组化法检测116例HCC 组织标本中抑癌基因Merlin 与LCSC 表面标记物Nanog 的蛋白表达，分析两者的表达与HCC 患者临床病理因素及预后间的关系。
结果：按X -tile 软件计算得出的Merlin 与Nanog 表达量的分界值，116例HCC 中Merlin 低表达者92例（79.3%），高表达者24例（20.7%）；Nanog 高表达者36例（31.0%），低表达者80例（69.0%）。单因素分析显示，分化较差，有卫星灶、静脉浸润、出血坏死的HCC 组织中Merlin 低表达，而Nanog 高表达（均P<0.05）；多因素分析显示，Merlin 低表达和Nanog 高表达是HCC 术后存活和复发的独立的预测指标（均P<0.05）。将患者分为低危组（Merlin 高表达并Nanog 低表达）、中危组（Merlin 高表达并Nanog 高表达或Merlin 低表达并Nanog 低表达）、高危组（Merlin 低表达并Nanog 高表达）分析，3组患者的术后总体生存率（低危组>中危组>高危组）和复发率（低危组<；中危组<；高危组）差异均有统计学意义（均P<0.05）。
结论：抑癌基因Merlin 失活与Nanog 高表达有一定关系，两者的消长与HCC 患者预后密切相关。
关键词
肝肿瘤；癌，肝细胞；基因，肿瘤抑制；肿瘤干细胞中图分类号：R735.7
Relationship between expressions of cancer suppressor gene Merlin and stem cell marker Nanog in hepatocellular carcinoma and the significance
OUYANG Xiwu 1, FENG Tiecheng 1, ZHANG Sai 2, TAO Yiming 1, WANG Zhiming 1
(1. Department of Liver Surgery 2. Research Institute of Medical Sciences, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)
Abstract Objective: To investigate the relationship between inactivation of cancer suppressor gene and liver cancer stem
cells (LCSC) in hepatocellular carcinoma (HCC) and the clinical signifi  cance.
Methods: Th  e protein expressions of cancer suppressor gene Merlin and LCSC surface marker in 116 specimens
·基础研究·
doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2016.07.013
/10.3978/j.issn.1005-6947.2016.07.013Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(7):1011–1016.
基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（81372631）；中南大学湘雅医院2014 年度临床科研基金资助项目（2014L07）；
湖南省发改委科研基金资助项目（湘发改高技[2013]1199）；“湘雅临床大数据系统”资助建设项目（22）。
收稿日期：2016-05-04； 修订日期：2016-06-16。
作者简介：欧阳锡武，中南大学湘雅医院硕士研究生，主要从事肝癌外科临床与基础方面的研究。通信作者：王志明， Email: wzmxycsu@hotmail
中国普通外科杂志第25卷1012
抑癌基因的失活是导致肝细胞癌（H C C）发生的重要分子机制之一[1]。肿瘤干细胞学说认为，肝癌干细胞（LCSC）在HCC的发生发展中具有重要作用[2]。目前研究[3]结果显示，L C S C表面标记物N a n o g表达上调促进了H C C发生发展，并与抑癌基因失活具有一定内在关系[4]。M e r l i n（或称S c h w a n n o m i n）蛋白为至今被证明的第一种具有肿瘤抑制作用的蛋白质[5]。笔者前期研究[6-7]发现Merlin在HCC组织和细胞系表达下调具有潜在抑癌基因功能。目前有关LCSC表面标记物联合抑癌基因在肝癌中的表达及预后鲜见报道。本文回顾性分析2010年2月—2010年10月间116例HCC病例，采用
免疫组织化学方法联合检测癌组织中Merlin、Nanog蛋白表达，并分析两者与HCC临床病理因素及其预后的关系。旨在探讨抑癌基因与LCSC表面标记物在HCC中的表达及关系。
1　资料与方法
1.1  一般资料
2010年2月—2010年12月间，收集湘雅医院肝脏外科肝切除116例HCC患者临床资料，HCC 确诊根据2010年版世界卫生组织（WHO）病理诊断标准[8]。其中男93例，女23例；H B s A g阳性者为97例（83.6%）；肿瘤最大直径≤5 cm 36例，>5c m80例。HCC出血坏死表型界定参照笔者以前的文献[9]报道，有出血坏死者为 79例，无出血坏死者为37例。
1.2  免疫组化
所有标本常规石蜡包埋制成4μm厚连续切片。采用免疫组织化学S P法检测M e r l i n和N a n o g 蛋白表达（抗体购自英国A b c a m公司，工作浓度1:500）在HCC中的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照。操作步骤按照免疫组织化学SP 试剂盒的说明书（福州迈新生物技术公司）。免疫染评分标准参照我们以前的文献报道[10]。
1.3  Merlin与Nanog蛋白表达量分界值值的选取
采用X-tile 3.6.1软件（Yale University School of Medicine，NewHaven，CT，USA）、最小P值法（minimum/optimal P value）确定的最佳分界点作为患者分组标准[11-12]。癌组织中Merlin和Nanog 蛋白表达水平分为低表达组及高表达组。
1.4  随访和观察指标
所有患者均每隔2~3个月复查胸片、AFP及肝脏超声检查，2年后复查门隔延长至6个月。对有可疑复发病灶行增强CT及MRI检查。116例患者中位随访期16.5（3~36）个月。观察总体生存率和无瘤生存率。
1.5  统计学处理
半定量资料组间比较采用Mann-Whitney U检
of HCC tissue were determined by immunohistochemical staining, and then the relations of their expressions
with clinicopathologic factors and prognosis of HCC patients were analyzed.
Results: According to the cut-off values of Merlin and Nanog expression levels calculated by X-tile soft ware, in the
116 HCC patients, 92 cases (79.3%) had low Merlin expression and 24 cases (20.7%) had high Merlin expression;
36 cases (31.0%) had high Nanog expression and 80 cases (69.0%) had low Nanog expression. Univariate
analysis showed that HCC tissues with poor differentiation, satellite lesions, venous invasion or hemorrhagic
necrosis had low Merlin but high Nanog expression (all P<0.05). Multivariate analysis showed that low Merlin
expression and high Nanog expression were independent predictors for postoperative survival and recurrence
(both P<0.05). After the patients were divided into low risk group (high Merlin and low Nanog expression),
medial risk group (high Merlin and high Nanog expression or low Merlin and low Nanog expression) and high
risk group (low Merlin and high Nanog expression), the analysis demonstrated that both overall survival rate (low
risk group>medial risk group>high risk group) and recurrence rate (low risk group<medial risk group<high risk
group) were statistically diff erent among the three groups (all P<0.05).
Conclusion: Inactivation of Nanog protein expression is related to inhibition of tumor suppression gene Merlin,
and their increase and decrease are closely linked to the prognosis of HCC patients.
Key words Liver Neoplasms; Carcinoma, Hepatocellular; Genes, Tumor Suppressor; Neoplastic Stem Cells
CLC number: R735.7
欧阳锡武，等：抑癌基因Merlin 与干细胞标记物Nanog 在肝细胞癌中表达的关系及意义
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验。采用Kaplan -Meier法计算总体生存率和无瘤生存率，Log -Rank法比较总体生存率和无瘤生存率之间的差异。以上统计均采用SPSS 18.0软件进行分析。
2　结　果
2.1  Merlin 和Nanog 蛋白在肝癌组织中的表达
免疫组化显示，癌组织标本中，M e r l i n 蛋白染阳性细胞主要是H C C 细胞胞浆（图1A ），N a n o g 蛋白染阳性细胞主要是H C C 细胞胞核（图1B）；Merlin表达水平低于邻近非癌肝组织（P<0.05），而Nanog表达水平高于邻近非癌肝组
织（P<0.05）（图1C）。
2.2  Merlin 和Nanog 表达水平与临床病理因素的
关系
使用X -tile软件结合随访资料计算出癌组织标本中Merlin和Nanog蛋白的分界值，进而把Merlin 和N a n
o g 蛋白的表达分成高表达组和低表达组（图2）。其中Merlin低表达组92例（79.3%），高表达组24例（20.7%）；N a n o g 高表达组36例（31.0%），低表达组80例（69.0%）。
单因素分析结果显示，分化较差、有卫星灶、镜下静脉浸润、出血坏死的HCC组织中Merlin 的表达水平较低，N a n o g 的表达水平较高（均P<0.05）（表1）。
图2　X -tile 软件确定Merlin 和Nanog 蛋白表达水平基于总体生存率的分界值
Figure 2　Cut-off  values of Merlin and Nanog expression levels calculated by X-tile soft  ware based on overall survival data
0            12            24            36          48            60
时间（月）
100806040200
生存率（%）
0            12            24            36          48            60
时间（月）
100806040200
生存率（%）
Merlin
0.2                                        1.5                                        2.8
10
Nanog
9
0.2                                  1.5                                            4.0
高表达（n =24）低表达（n =92）
高表达（n =80）低表达（n =36）
图1　免疫组化检测结果（×200）  A：Merlin 蛋白表达情况；B：Nanog 蛋白表达情况；C：免疫组化评分比较
欧阳夏丹简介
Figure 1　Results of immunohistochemical staining (×200)  A: Merlin protein expression; B: Nanog protein expression; C: Comparison
of scores of immunohistochemical staining
Merlin
54321
543210
Nanog
癌旁组织癌旁组织HCC HCC A                                                    B                                                                                      C
P <0.01
P <0.01
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2.3  Merlin 和Nanog 表达水平与HCC 患者预后
的关系
在单因素生存分析中，性别，白蛋白水平，有无肝炎史，有无肝硬化等对总体生存率和无瘤
生存率均无统计学意义（均P >0.05），未纳入多因素分析。多因素分析显示，M e r l i n 低表达和Nanog高表达是HCC术后存活率的独立的预测指标（均P<0.05）（表2）。
表1　Merlin 与Nanog 蛋白表达与HCC 临床病理特征的关系[n （%）]
表2　116例HCC 单因素和多因素分析生存复发风险因素
　中危 vs. 低危0.010  2.289  1.315~4.8470.0070.009  2.412  1.481~6.628<0.001　高危 vs. 低危<0.001  4.025  2.124~9.457<0.001<0.001  4.372  2.326~9.824<0.001　高危 vs. 中危<0.001  2.966  1.821~8.186<0.001<0.001  3.305  1.642~8.264<0.001
欧阳锡武，等：抑癌基因Merlin 与干细胞标记物Nanog 在肝细胞癌中表达的关系及意义
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根据患者M e r l i n 与N a n o g 的表达情况，将患者分为：低危组（Merlin高表达并Nanog低表达）28例，中危组（M e r l i n 高表达并N a n o g 高表达或M e r l i n 低表达并N a n o g 低表达）50例，高危组（Merlin低表达并Nanog高表达）38例，3组患者
的术后总体生存率（图3A）与复发率（图3B）差异均有统计学意义（均P<0.05），总体生存率：低危组>中危组>高危组；复发率：低危组<；中危组<；高危组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。
3　讨　论
M e r l i n 和H C C 的发生具有密切的关系。近期研究[13]显示，在肝脏特异性Merlin基因敲除鼠中，
在发育的基因剔除小鼠会发生肝祖细胞（即肝卵圆细胞，O C s ）过度增生，并最终基本全部发生HCC，且容易转移到肺，证明了Merlin基因在HCC 的发生发展中具有关键的抑制作用。分子机制涉及：⑴ 肿瘤中M e r l i n 其编码基因发生突变时，P21活化激酶（p21-activated kinase，PKA）调控Merlin分子自身在“开放”状态和“封闭”状态之间的转换[14]；⑵ Merlin表达下降或缺失，转化生长因子β（TGF -β）活化Wnt/β-catenin信号通路；⑶ Merlin蛋白通过折叠蛋白KSR1调节肿瘤抑制作用[15]；⑷ 活化FAK通路生长、增殖水平和迁移能力以及细胞与基质黏附附能力。
此前人们已经发现Nanog不仅表达在胚胎原性肿瘤以及生殖细胞肿瘤中，而且在其他类型的肿瘤包括肝癌中均有表达[3]
。本研究免疫组化实验数据显示，大多数的肝癌患者样本中出现Merlin低表达和Nanog高表达，特别是在与低分化程度、出血坏死以及血管浸润的肝癌中。值得注意的是，肝癌中Merlin低表达和Nanog高表达与临床上的不良预后相关，提示其作为肝癌预后诊断的可能性。
将两种指标联合起来考虑后发现高表达干细胞标记物Nanog合并Merlin低表达患者术后生存曲线明显较干细胞标记物阴性表达且Merlin高表达组患者差。本研究结果表明，癌组织中Merlin与Nanog可作为判断H C C 恶性程度及进展的指标。M e r l i n 与Nanog水平与HCC患者术后复发和生存有关，两者联合检测可为H C C 的早期诊断、进一步及判断预后提供必要的理论依据。
参考文献
[1] Arzumanyan A, Reis HM, Feitelson MA. Pathogenic mechanisms
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中国普通外科杂志, 2015, 24(1): 110-115.
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features of hepatocellular carcinoma cells[J]. Gastroenterology, 2015, 149(4):1068-1081.
100806040200
复发率（%）
I（n =28）II （n =50）III （n =38）0            12            24            36          48            60
时间（月）
100806040200
总体生存率（%）
I（n =28）
II （n =50）III （n =38）P <0.01
P <0.01
0            12            24            36          48            60
时间（月）
A
B
图3　Merlin 和Nanog 蛋白表达与HCC 预后的关系  A：术后生存率；B：复发率
Figure 3　Relations of Merlin and Nanog protein expressions with prognosis of HCC  　A: Postoperative survival; B: Recurrence rate