葡萄酒的酿制及酵母菌的检测
一．实验目的
1.了解实验室酿造葡萄酒的过程；
2.研究酿造酒各个发酵阶段中的微生物类型及数量变化；
3.研究葡萄酒酿造过程中酸度、糖度、酒精度的变化过程；
4.分离鉴定酵母菌及乳酸细菌。
二．实验原理
葡萄酒是一种营养丰富的低酒精度发酵饮料，是由新鲜完好的葡萄经酒精发酵和陈熟等工艺制成的。葡萄酒发酵可以采用自然发酵，也可以采用纯种发酵。发酵的温度为21〜32°C,发酵时间3〜5天，对良种酵母产乙醇量可达14%〜18%。发酵后进行“烧酒”，即将酒汁从发酵残渣或沉淀中压出，在残渣和沉淀中含有酒石酸氢钾。在储存和陈化过程中酒会发生自然沉清并形成特有的风味。
葡萄酒经过酒精发酵后,新酒中往往含有较多的苹果酸,它残留在酒中会使成品酒口感粗糙生硬，需经过MLF新酒的酸度降低，口感变得柔和圆润。细菌和酵母会导致佐餐葡萄酒的变质腐败,有效假丝酵母是其中最重要的一种,这些菌在酒液表面生长形成一层菌膜，造成酒的浑浊。导致葡萄酒变质的细菌主要是一些醋酸杆菌属菌，它们氧化乙醇产生乙酸（产醋）。
在葡萄酒生产中，葡萄汁必须含17%的糖，才能生成10°的酒，只有10°以上的酒才能保持长久，糖分不足就须加糖。如果葡萄汁酸度不足，各种有害细菌就会生长，对酵母发生危害，因此，酸度不足就须调酸，常加酒石酸、柠檬酸，在酸性（PH=3.5）条件下，酵母菌生长良好，抑制有害细菌生长，使发酵顺利进行，红葡萄酒得到鲜明的颜。
三．实验试剂及仪器
1.基础材料：市售冰鲜紫葡萄、蔗糖、红星52度白酒、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、琼脂、硫酸镁加入、孟加拉红、蒸馏水、酵母菌、棕玻璃瓶、发酵瓶、一次性手套、消毒搅拌棒、捣碎杯、锥形瓶、盖玻片、玻璃珠、平皿、涂布棒、小烧杯、不锈钢长药匙、10mL吸管等。
2.仪器：振荡培养箱、超净工作台、生化培养箱、干燥箱、高压蒸汽灭菌器、生物显微镜、酸度计、手持式折射仪等。
四．实验步骤
1.准备2.5L或5L棕广口玻璃瓶若干只，清洗消毒备用。
2.制作葡萄酒及相关数据的测定（首日）
⑴将葡萄用剪刀从蒂处剪下洗净并剔除烂果，于通风干净处沥干，用消毒过的手戴上消毒手套将葡萄除梗并捏碎，连同葡萄皮、籽、果肉一起放入上述备用容器中，保留容器1/3的空间，按10：1的比例加入白糖，使糖度达24%左右。用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，盖上盖子，避光存放7〜10天。
⑵取若干个葡萄，分别挤压处葡萄汁，用校零好的糖度计和酒度计测定其糖度及酒精度，取平均值。取适量前发酵液测其酸度。
⑶酵母菌的分离和初步鉴定
a.配制孟加拉红培养基。在1L蒸馏水中溶解蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾lg,琼脂20g，硫酸镁0.5g，加入1/3000孟加拉红溶液100mL，于115摄氏度灭菌30分钟。
b.稀释液的制备。取酒液10mL与90mL的无菌水充分振摇混匀，此为稀释液10-1，取10-1稀释液1mL与9mL的无菌水充分混匀，此为稀释液10-2，以此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的葡萄酒溶液。
c.酵母菌的分离与计数。倒15mL孟加拉红培养基于培养皿中，待凝固后，取不同稀释度（稀释度的确定在不同的发酵阶段是不一样的，须考虑待测液中酵母菌的含量）的稀释液0.1mL涂布于培养基上，每一稀释度做3个平行，倒置培养于25-28°C培养箱中2-3天。待有红菌落长出后，进行菌落计数，并挑取有代表性的单菌落转接至PDA培养基斜面上培养保存，同时将细胞涂片染进行显微镜镜检，若不纯，则进行PDA平板划线分离，直至获得纯培养。
d.酵母菌的初步鉴定。将上述分离得到的酵母菌斜面菌种，通过对其菌落特征及个体形态的分析，根据《真菌鉴定手册》做出初步的鉴定，进一步的确切鉴定应以有关的生理生化鉴定为主。
3.2〜3天后可见发酵液中有大量CO2气泡产生，形成酒帽并上浮，每日三次用玻棒搅动发酵液，把上浮皮渣压入酒液，使发酵充分、素抽提完全，并防止杂菌在表面生长。
4.新酒分离（7〜10天后）。待发酵平稳后，采用乳胶管虹吸法把清酒吸入另一经消毒的瓶内，残余酒脚用消毒纱布挤压过滤，将酒液装入酒瓶并保留适量酒液，酒瓶必须盛满酒液，密封后室温下静止摆放，进入后发酵阶段。取预留酒液测定其糖度、酒精度、酸度。按上述步骤分离酵母菌并记数。
5.后发酵（2周后）。待葡萄酒继续经过一周时间的发酵，酒液中的糖分及酒精度基本保持恒定，酒度已达10度以上，已具有了防腐的能力，保留适量酒液后再次进行虹吸倒酒至另一洁净酒瓶中，进入陈酿阶段。取预留酒液测定其糖度、酒精度、酸度。按上述步骤分离酵母菌并记数。
五．实验数据及处理
葡萄品种：夏黑等；
葡萄总重量：3.309kg；加糖：290g；白葡萄酒酵母：0.4g；
结果:
表1酵母菌菌落数量
天数
稀释系列
读数稀释度
菌落总数
0
100,10-1,10-2
未计数
未计数
100,10-1,10-2
未计数
未计数
12
10-3,10-4,10-5,10-6
10-4
3.3X107
10-4,10-5,10-6,10-7
10-5
3.7X107
19
100,10-1,10-2,10-3
10-2
9.0X105
10-1,10-2,10-3,10-4
10-2
9.8X105
葡萄酒酿造表2葡萄酒糖度、酒精度、酸度
天数
糖度
酒精度
pH值
0
16.9%
0%
3.88
9
8.0%
11.3%
4.07
16
7.8%
11.4%
4.11
以下图1及图2是由上述数据绘成的PH值变化的曲线图及糖度、酒精度变化的曲线图。
图2葡萄酒酿造过程中糖度、酒精度的变化过程
六．注意事项
1.原料必须选择新鲜无污染无霉烂的葡萄。
2.本实验严格实行无菌操作，所有的器具及操作者的手都要进行彻底的清洗及消毒，并在无菌室内实验。
3.倒酒后葡萄酒必须盛满酒瓶并密封。
七．实验小结
通过本实验我们了解实验室酿造葡萄酒的过程，自己亲手制作了葡萄酒，检测了各个阶段酒液的糖度、酒精度、酸度、微生物种类及数量。由于缺乏实验经验，在第一次酵母菌的分离中未能成功分离出酵母菌，使实验结果缺少了一组数据。在老师的指导下，我们总结了经验教训，并在之后两次实验中成功分离了酵母菌。
通过项目的实施，可以感受到这既是一次学习的过程，也是一次提高的过程。通过训练，开拓思路，为今后设计出更有意义的创新项目起到一个良好的开端。八．思考题
(1)传统自然发酵与纯种发酵相比，不同处在哪里？各有哪些优势和不足？
1自然发酵
自然发酵是将葡萄破碎后，不另添加酵母，利用葡萄皮上自带的野生酵母菌任其自然发酵，民间多采用自然发酵的方法生产葡萄酒。
优点：因发酵缓慢，发酵产生的能量低，发酵后的葡萄酒口感好，香气可能较特殊。
缺点：葡萄上带有复杂的微生物落，菌不明，与纯种发酵相比，自然发酵的初期发酵缓慢，易被杂菌感染葡萄汁，发酵风险大，启动困难，容易发酵中止，容易发酵不彻底，容易产生杂醇，容易产生高挥发酸，最后的发酵结果不可控。
2纯种发酵
纯种发酵葡萄酒就是将优良的葡萄酒酵母菌株添加到葡萄酒发酵中，做出来的葡萄酒品质更好，口感更纯。
优点：酵母使用单一快速，避免了杂菌感染的机会，提高果酒的品质。缺点：纯种发酵使用单一的微生物，参与生化反应的酶系不多，代谢产物较少，生产成分单一，所得葡萄酒风味较差。
(2)用自然发酵法酿造葡萄酒应注意哪些问题？如何才能提高自酿酒的品质？
注意点：①原料的选择：原料必须选择新鲜无污染无霉烂的葡萄，有些人专门挑廉价的或卖不掉的质次葡萄然后添加大量的白糖来酿造，这无疑会给健康带来很大的危害。②在制作过程中必须做到清洁卫生，应有条件做好消毒工作，避免带入外来杂菌。③应有制作的知识，曾出现过爆炸的事件，完全是盲目制作带来的后果。近来听说有饮用了自酿酒致失明的事，有人表示是由于自酿酒含有甲醇的缘故。对于这一问题应引起高度的重视，有待进一步的探索。
提高品质：适宜的发酵温度、适宜的发酵时间、良好的密封条件、优质的葡萄原料、PH值良好的发酵用水等。
(3)MLF在葡萄酒发酵中的意义及作用？
葡萄酒经过酒精发酵后，新酒中往往含有较多的苹果酸，它残留在酒中会使成品酒口感粗糙生硬，一些乳酸细菌可以较专一的分解葡萄酒中的苹果酸，产生乳酸和二氧化碳，这一过程称为苹果酸-乳酸发酵（MLF）。能进行MLF的乳酸菌主要是乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属等特殊种的乳酸菌。