2021年第47卷第1期(总第421期)
79
㊀DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.025161
47(1):79-87.WANG Jing,LI Min,GAO Pingping,et al.Application potential of Lachancea thermotolerans and Torulaspora delbrueckii on ice wine fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):79-87.
耐热克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母在冰葡萄酒酿造中的应用潜力
王婧1,2∗，李敏1,2，高娉娉1,2，赵美1,2，杨婕1,2
1(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州,730070)
2(甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃兰州,730070)
摘㊀要㊀为了研究耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)和戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)在冰葡萄酒酿造中的应用潜力，该文对不同来源的3株L.thermotolerans(LT1㊁LT2㊁LT3)和3株T.delbrueckii(TD1㊁TD2㊁TD3)菌株的嗜杀性及在冰酒生境下的生长动态㊁耐受性及其发酵特性进行分析㊂结果表明：供试的L.thermotol-erans 和T.delbrueckii 菌株对冰酒发酵条件均具有良好的适应性；其中菌株LT2和TD2在葡萄糖质量浓度为400~500g /L ㊁乙醇体积分数为15%㊁SO 2质量浓度为400mg /L ㊁温度在13~19ħ的条件下均可保持良好的定殖能力;3株L.thermotolerans 和TD2菌株对酿酒酵母1296菌株具有较强的嗜杀性;LT2菌株发酵冰葡萄汁时的乳酸产量最高，为2.195g /L ;LT2和TD2菌株纯种发酵的冰酒乙醇体积分数能达到11%~12%，并且酒样中挥发性酯类㊁有机酸类物质的总含量比酿酒酵母纯种发酵的酒样显著降低，挥发性萜烯类物质含量显著增加；感官分析表明,TD2菌株纯种发酵的冰葡萄酒有较强花㊁果香气;LT2菌株能够增强冰葡萄酒的酸度，有助于平衡冰酒的甜腻感，使口感协调㊂综上所述,LT2和TD2菌株纯种发酵对冰葡萄酒的感官品质有一定的积极影响,L.thermotoler-
ans 和T.delbrueckii 具有酿造冰葡萄酒的应用潜力㊂
关键词㊀耐热克鲁维酵母；戴尔有孢圆酵母；冰葡萄酒；发酵特征；挥发性香气
第一作者：博士，副教授(通讯作者,E-mail:wangjing@gsau.edu)㊂
基金项目：国家重点研发计划项目(2019YFD1002500)；甘肃省高校教师基本科研能力提升项目(2018
A-033)收稿日期:2020-07-25，改回日期:2020-08-11
㊀㊀冰葡萄酒属于高档甜型葡萄酒，因原料稀缺，酒体醇厚甘甜㊁香味浓郁而成为葡萄酒中的珍品[1]㊂近年来，由于全球气候变暖，使酿酒葡萄果实出现成熟速度加快，糖分含量逐渐升高，酸度逐渐下降，风味
物质含量降低等趋势[2]，原料也不可避免的出现酸度缺乏㊁香气复杂性欠缺等问题㊂酵母菌在葡萄酒酿造过程中的代谢活动会伴随着甘油㊁酸类㊁醇类㊁酯类等物质的生成而对葡萄酒质量风格产生重要影响[3]㊂近年来，随着对葡萄酒相关酵母菌种的深入研究发现，一些具有潜在应用价值的非酿酒酵母具有独特的代谢通路和较强的酶活力，可以产生较低的酒精㊁增加甘油㊁调节酸度㊁释放甘露糖蛋白或多糖，改善葡萄酒口感㊁增强颜稳定性以及香气复杂性，且不同种属的非酿酒酵母的贡献也各不相同[4]㊂耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans )属于Lachancea 属[5]，在酒精发酵过程中主要产生乳酸以增加温带葡萄种植区葡萄酒的酸度，有 生物酸化剂 之称[6]㊂
此外,L.thermotoleran s 亦能够改善葡萄酒的一些质量
参数[7-12]㊂戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii )
在非酿酒酵母中具有较强的酒精发酵能力[13]，与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )相比能够耐受
葡萄汁中较高的渗透压[14]，产生低浓度的乙酸和高级醇类，较高浓度的萜烯类物质[15]㊂在工业化水平上,T.delbrueckii 也是最早进入商业化应用的非酿酒酵母菌株[16]㊂目前关于L.thermotoleran s 和T.delbrueckii
在干型葡萄酒上的研究报道较多，而在冰葡萄酒中应用研究报道较少，尤其冰葡萄汁的发酵条件与其他类型的葡萄酒差异较大，其酒精发酵是在高渗透压和高浓度SO 2以及低温条件下进行，因此，针对非酿酒酵母菌株在冰葡萄酒生境下酿造特性的研究对于酵母资源的进一步开发利用具有积极意义㊂
本试验对实验室保存的L.thermotoleran s 和T.delbrueckii 菌株的嗜杀性㊁生长动态㊁耐受性㊁在冰葡萄酒生境下的发酵特性以及主要挥发性香气化合物种类㊁含量等进行分析，旨在评价两菌株在冰葡萄酒酿造中的应用潜力㊂
酿酒葡萄80
㊀2021Vol.47No.1(Total 421)
1㊀材料与方法
1.1㊀试验材料
贵人香 冰葡萄汁:2018年11月购于甘肃祁连
葡萄酒业有限责任公司，含糖量为34.45ʎBrix㊁可滴定酸(以酒石酸计)6.75g /L；当天运抵实验室，加入60mg /L SO 2于4ħ冰箱贮藏备用㊂
供试菌株Lachancea thermotolerans :LT1保藏于中
国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC，保藏编号33099)；菌株LT2由甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室筛选于自然发酵的葡萄醪中，根据其在WLN(wallerstein laboratory nutrient)鉴别培养基上的菌落形态，经26S rDNA D1/D2区测序，其序列在NC-
BI 上blast 比对与Lachancea thermotolerans 的序列100%匹配(登录号MH472648.1)；菌株LT3保藏于CICC(保藏编号2.4066)㊂Torulaspora delbrueckii :TD1菌株来源于上海工业试验所(保藏编号1004)；菌株TD2来源于山东扳倒井股份有限公司(保藏编号33295)；菌株TD3来源于甘肃省科学院生物研究所(保藏编号32851)㊂酿酒酵母活性干粉:CECA(编号SC)，安琪酵母公司提供；敏感菌株S.cerevisiae 1296：西北农林科技大学葡萄酒学院赠送㊂1.2㊀仪器与试剂
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dex-trose,YEPD)培养基(g /L)：酵母浸粉10.0㊁葡萄糖20.0㊁蛋白胨20.0㊁琼脂20.0;YEPD-MB 培养基：在YEPD 培养基的基础上，用0.1mol /L 的柠檬酸磷
酸盐缓冲液调节pH 至4.6后，加入20.0g /L 琼脂和0.3g /L 亚甲基蓝指示剂㊂以上培养基均现用现配，并于121ħ高压灭菌20min 备用㊂
主要试剂:2-辛醇(谱纯),SIGMA-ALDRICH (上海)贸易有限公司;L -苹果酸和L -乳酸(谱纯)，上海源叶生物科技有限公司;NaOH㊁NaCl㊁Na 2CO 3㊁盐酸㊁醋酸钠㊁醋酸㊁无水葡萄糖等试剂(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司㊂
主要仪器:SW-CJ-2FD 超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;500051S 立式高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂;SPX-150-II 生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;Genesis 10s 紫外-可见分光光度计㊁Ultimate 3000高效液相谱仪㊁TRA-CE1310-ISQ 气相谱质谱联用仪，美国Thermo Sci-entific 公司㊂1.3㊀实验方法
1.3.1㊀菌株活化和种子液制备
挑取供试菌株单菌落于YEPD 液体培养基中，在
28ħ培养箱中培养48h，以2%的接种量分别接种于YEPD 液体培养基中，培养48h 后进行酵母菌接种试验(细胞生物量均达到108CFU /mL)㊂1.3.2㊀菌株嗜杀性测定
参照ULLIVARRI 等[17]的牛津杯抑菌法㊂将敏
感菌株S.cerevisiae 1296以2%的接种量接种于YEPD 液体培养基中,28ħ培养48h 后，稀释菌悬液至107CFU /mL，取100μL 涂布于YEPD-MB 培养基，再取200μL 供试菌株的菌悬液分别加入牛津杯中,
28ħ培养48h 后，观察并测定酵母菌株周围蓝的死菌带，测定抑菌圈直径与菌落直径，其差值表示抑菌圈大小㊂
1.3.3㊀菌株生长曲线测定
参照杨婕等[18]的方法并略作修改㊂分别挑取各供试菌株的单菌落于YEPD 液体培养基,28ħ条件下培养48h，再以2%的接种量分别接种于YEPD 液体培养基中,16ħ条件下培养，每隔2h 取250μL 菌液于离心管中，以未接种的YEPD 培养基作为空白对照，使用紫外分光光度计测定OD 630nm 的吸光值，绘制生长曲线㊂
1.3.4㊀菌株耐受性测定
参照杨婕等[18]和刘灿珍等[19]的方法并略作修
改㊂以酿酒酵母SC 为对照，分别测定3株L.thermo-tolerans (LT1㊁LT2㊁LT3)和3株T.delbrueckii (TD1㊁TD2㊁TD3)菌株的耐高糖㊁耐高酒精㊁耐高浓度SO 2及耐低温性能㊂将各菌株种子液以2%的接种量分别接种于葡萄糖质量浓度分别为250㊁300㊁350㊁400㊁450㊁500g /L，乙醇体积分数分别为6%
㊁9%㊁12%㊁15%;SO 2质量浓度分别为100㊁200㊁300㊁400mg /L，温度为10㊁13㊁16㊁19ħ的YEPD 液体培养基中，于28ħ条件下培养24h，使用紫外分光光度计测定不同处理下的供试酵母菌株的OD 630nm 的吸光值㊂
1.3.5㊀菌株发酵特性试验
将各菌株种子液以2%接种量分别接种于水浴杀菌
处理的冰葡萄汁中进行纯种发酵(初始菌体数量均为107CFU /mL)，每个样品设3个平行㊂其中，水浴灭菌处理是将冰葡萄汁分装于无菌棕罐中，装液量为70%,
60ħ水浴10min [2]，水浴处理后取样进行平板计数，其灭菌后菌落总数小于10CFU /mL，具有可行性㊂1.3.5.1㊀乳酸测定
参照BUGLASS 等[20]和PEREZ 等[21]方法，并略
作修改，采用高效液相谱仪进行测定㊂谱条件：谱柱BDS HYPERSILC18(250mmˑ 4.6mm, 5μm)；检测器为二极管阵列检测器；流动相为0.005 mol/L的硫酸水溶液；流速0.5mL/min；柱温为30
ħ；进样量20μL；检测波长210nm㊂
定性定量：将不同浓度的乳酸标准液分别进样，根据保留时间㊁出峰时间进行定性；以不同标准液的浓度，出峰面积进行定量，并绘制标准曲线，得到乳酸含量的标准曲线方程(y=10.768x+0.0355,R2=0.9997)㊂1.3.5.2㊀酒样理化指标测定
参照GB/T15038 2006‘葡萄酒㊁果酒通用分析方法“[22]对残糖㊁乙醇体积分数㊁挥发酸㊁总酸等基本理化指标进行测定㊂
1.3.6㊀小容器发酵试验
1.3.6.1㊀ 贵人香 冰葡萄酒酿造工艺
冰葡萄酒酿造工艺参照李景明等[1]的方法；巴杀处理参照BENITO等[2]方法并略作修改:
冰葡萄汁ң加SO2(60mg/L)㊁果胶酶(20mg/L)处理ң巴氏杀菌处理(65ħ,10min)ң接种试验ң16ħ(低温发酵)ң终止发酵ң倒罐ң陈酿ң指标测定
1.3.6.2㊀菌株单独接种试验
将各菌株种子液分别以2%接种量接种于水浴杀菌处理的冰葡萄汁中进行纯种发酵(初始菌体数量均为107CFU/mL)，将接种酒样置于恒温培养箱中发酵，当乙醇体积分数达到10%~11%时降温至0ħ左右，
并添加SO2至120mg/L，终止发酵，密封陈酿3个月后测定主要理化指标及挥发性香气化合物㊂1.3.7㊀挥发性化合物测定
参照王玉华等[8]的方法，采用顶空固相微萃取-谱质谱联用仪(headspace solid phase microextrac-tion-gas chromatography-mass spectrum,HS-SPME-GC-MS)进行测定㊂
HS-SPME处理：取8mL酒样于萃取瓶中，加入2.40g NaCl及10μL8.82mg/L2-辛醇(内标物)，放入磁力搅拌转子密封后，置于磁力搅拌器上摇匀，于40ħ下水浴平衡30min，插入萃取头磁力搅拌吸附富集30min㊂
GC-MS条件:DB-WAX(60mˑ2.5mm,0.25μm)谱柱；柱升温程序:40ħ保持7min，以4ħ/min升至200ħ，保持8min；载气:He，纯度99.99%；流速:1.0mL/min；进样口温度:240ħ；不分流进样㊂电子轰击离子源(EI)；离子源能量70 eV；传输线温度:220ħ；离子源温度:240ħ；质谱扫描范围50~350m/z㊂
定性分析：采用质谱全离子扫描图谱，根据本实验室在相同检测条件下建立的各化合物的保留时间㊁保留指数和质谱信息以及标准质谱库检索比对进行定性分析㊂
定量分析：采用内标法进行半定量分析，按公式(1)进行计算:
ρ=
A1ˑρ内
Aˑf(1)
式中:ρ，香气物质的质量浓度;ρ
内，内标物的质量浓度;A1，测得香气物质的峰面积;A，测得内标物的峰面积;f，内标物的校正因子,f=1㊂
气味活性值(odor activity value,OAV)：香气物质的含量与嗅觉阈值的比值㊂
1.3.8㊀感官分析
参照GB/T15038 2006‘葡萄酒㊁果酒通用分析方法“[22]㊂按表1的评分标准给酒样打分[23-24]㊂
表1㊀冰葡萄酒感官评分标准
Table1㊀Criteria for sensory evaluation of ice wine 项目指标评分标准(分)
外观泽浅绿(0~3)；浅黄(4~6)；金黄(7~9)
澄清度酒体浑浊不透明，有明显悬浮物(0~3)；酒体少许浑浊，略带悬浮物(4~6)；澄清透明，无明显悬浮物，悦目协调(7~9)
香气花香花香弱(0~3)；花香中等(4~6)；花香强(7~9)
果香果香(菠萝㊁水蜜桃等热带水果味)非常弱(0~3)；果香味中等(4~6)；果香味强(7~9)
异味异味弱(0~3)；异味中等(4~6)；异味明显(7~9)
香气强度
气味浓度弱，无浓郁的花果香和酒香(0~3)；气味浓度中等，有少许浓郁的花果香和酒香(4~6);
气味浓度强，具有纯正愉悦㊁浓郁和谐的花果香和酒香(7~9)
口感酸度无酸味(0~3)；酸度较低，酒样品尝起来平淡无奇(4~6)；酸度适中，口腔中酸度刺激感(7~9)酸甜平衡感甜酸平衡感差(0~3)；甜酸平衡感欠佳(4~6)；甜酸平衡感好，酒体协调(7~9)
整体评分香气单一，余味短，平衡感差(0~3)；香气清新且较复杂，余味较长，甜酸平衡感较好(4~6);
香气清新㊁复杂，余味长，甜酸平衡感好(7~9)
2021年第47卷第1期(总第421期)81
㊀
82
㊀2021Vol.47No.1(Total 421)
1.4㊀数据分析
所有试验均设3次重复㊂采用Excel 2010进行数据处理,SPSS 23.0对数据进行单因素方差分析，利用Duncan s 多重比较在置信区间P <0.05下对数据进行差异显著性分析，对不同处理酒样的香气化合物进行主成分分析㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀菌株嗜杀性测定
嗜杀性是酿酒酵母生理特性的重要指标之一，嗜杀性强的菌株能更好的保障葡萄酒正常的发酵过程，
拮抗其他微生物的干扰㊂图1为6株供试菌株对于敏感菌株S.cerevisiae 1296的嗜杀性㊂由图1可知,3株L.thermotolerans 具有嗜杀性，抑菌圈的直径分别为2.32㊁2.8和2.25mm，其中LT2的嗜杀性最强㊂
3株T.delbrueckii 中只有TD2具有嗜杀性，抑菌圈的大小约为2.3mm㊂
图1㊀供试菌株嗜杀性结果
Fig.1㊀Homicidal results of the tested strains
2.2㊀L.thermotolerans 和T.delbrueckii 供试菌株的生长曲线
由图2可知，在16ħ低温条件下,3株L.thermo-tolerans 菌株的生长趋势大致相同(图2-a)，均经过了
4~6h 的延滞期，然后需8~10h 的指数生长期，在第18小时以后菌体数量达到稳定期㊂在指数生长期,L.thermotolerans 的生长速率略低于对照SC，但达到稳定期后菌体数量基本一致㊂3株T.delbrueckii 在经过6h 的延滞期后需10~14h 的指数生长期，并于第20~22小时达到稳定期(图2-b)㊂3株T.del-
brueckii 菌株在指数生长期的生长速率明显低于SC，达到稳定期后菌体数量也均较低于SC㊂2.3㊀菌株耐受性分析2.3.1㊀高糖耐受性a-L.thermotolerans 菌株;b-T.delbrueckii 菌株
图2㊀供试菌株在YEPD 培养基中的生长曲线Fig.2㊀Growth curve of tested strains in YEPD medium
冰葡萄酒是在低温下高糖发酵的一种甜型葡萄酒，冰葡萄汁中的糖度通常大于350g /L，是发酵液中高渗透压的主要因素，对酵母的生长繁殖具有一定胁迫抑制作用[25]㊂由图3-a 可知，随着葡萄糖质量浓度的增加，酿酒酵母SC 及供试的6株非酿酒酵母菌株的OD 值均呈下降趋势，但各菌株表现出的耐受性差异较大㊂当葡萄糖质量浓度在250~400g /L 时，所有菌株的OD 值均大于1.2，但LT1㊁LT3和TD1菌株的OD 值显著低于其他菌株；当葡萄糖质量浓度达到500g /L 时，供试的6株非酿酒酵母菌株的OD 值显
著低于SC，其中,TD1菌株的OD 值最低(约为0.6)，只能进行微弱生长,LT2菌株显著高于其他几株非酿酒酵母菌株㊂因此，本试验中3株L.thermotolerans 菌株和TD2㊁TD3菌株对高糖环境的适应性较强㊂2.3.2㊀高SO 2的耐受性
在冰酒酿造中，当达到所需酒度时需要终止发
酵，通常采取的措施是添加高浓度SO 2及降低温度㊂如图3-b 所示，以酿酒酵母SC 为对照,6株供试菌
株的OD 值均随着SO 2质量浓度的增加而呈现下降的趋势，但LT1菌株与其他菌株相比对SO 2的敏感性较强，当SO 2质量浓度为100mg /L 时其生长受到明显抑制；菌株LT2㊁LT3在SO 2质量浓度达到400mg /L 其耐受性与SC 差异不显著，但显著高于3株T.delbrueckii 菌株，由此可知，菌株LT2㊁LT3具有非常强的SO 2耐受性，而3株T.delbrueckii 菌株之间对SO 2耐受性无显著差异㊂
2021年第47卷第1期(总第421期)
83
㊀a-葡萄糖;b-SO 2;c-乙醇;d-温度
图3㊀供试菌株在不同条件下的生长情况Fig.3㊀Growth of tested strains under different conditions
注：不同字母代表差异显著(P <0.05)(下同)
2.3.3㊀乙醇耐受性
大多数非酿酒酵母由于酒精耐受性不高而只能
存在于葡萄酒酒精发酵的前期和中期㊂而本研究中6株非酿酒酵母均具有较强的乙醇耐受性，由图3-c 可知，当乙醇体积分数达到15%时，耐受性最低的LT3菌株的OD 值也达到了1.5，其次，除了LT3和TD3菌株，其他4株供试非酿酒酵母菌株的OD 值与酿酒酵母SC 的差异不大，表明供试的几株非酿酒酵母均具有良好的乙醇耐受性，这一结果与已有报道结果基本一致[19,26]㊂
2.3.4㊀低温耐受性冰葡萄汁通常于初冬季节才能获取，通常将冰酒
酿造温度控制在10~19ħ的低温条件下进行㊂由图3-d 可知，当温度在10ħ时，供试菌株中只有酿酒酵母SC 和TD2菌株的OD 值大于0.5，表现出微弱的生长㊂随着温度升高，供试菌株的OD 值均呈上升趋势㊂当温度上升到16ħ时，除LT1菌株外其他菌株的OD 值均大于1.0，当温度达到19ħ时，供试菌株的OD 值均大于1.2，然而6株非酿酒酵母的OD 值均显著低于SC(OD 值1.8)，其中TD1㊁TD2菌株的OD 值均大于1.4，对低温的适应性较优于TD3和LT2菌株,LT1和LT3菌株的低温适应性弱于其他菌株㊂
2.4㊀L.thermotolerans 菌株乳酸生成量
对于冰葡萄酒来说，适量的有机酸类物质可提高葡萄酒的风味和口感，其甜酸协调的口感是冰葡萄酒的一个重要感官标准[8],L.thermotolerans 主要代谢特点是能够产生乳酸㊂由图4可知，在发酵温度为16ħ的条件下,3株L.thermotolerans 菌株对冰葡萄汁发酵过程中能够代谢产生L -乳酸,LT1㊁LT2和LT3均在第6天时达到最大值，分别为1.970㊁2.195和1.
705g /L，可以看出，在冰葡萄汁低温发酵的条件下,LT2菌株的L -乳酸含量显著高于其他2株L.thermotolerans ㊂
图4㊀三株L.thermotolerans 菌株的乳酸生成量
Fig.4㊀Production of lactic acid of three L.thermomotolerans strains
2.5㊀酒样理化指标分析
由表2可知，供试菌株酿制的冰葡萄酒主要理化指标均符合GB /T 25504 2010‘冰葡萄酒“[27]国家
发布评论