摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。mr.bio
关键词：蛋白质分离纯化
蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的最终控制者和直接执行者，它参与生物体内几乎所有的生命活动过程，如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述，为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则
1.1蛋白质分离纯化的特点
1）大多数蛋白质产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可
使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低，且物料组成非常复杂。例如，利用基因工程菌发酵生产蛋白质，物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等，目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体，为获取蛋白质，还需进行细胞破碎，结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶
降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用，因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则
1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
2）每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
3）蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段：
a.粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。
b.精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来[1]。
2 蛋白质分离纯化技术
2.1 传统技术
2.1.1 凝胶过滤层析
凝胶过滤层析又称分子筛层析或分子排阻层析，它是以具有网状结构的多孔高分子聚合物为固定相，利用组分中物质分子量的不同进行分离纯化的技术。大分子的物质难于进入微孔只能在流动相的带动下通过间隙快速流出，而小分子的物质则在微孔内外进进出出慢速流出，这样蛋白液的各个组分便按分子量由大到小的顺序流出柱体。它是一种快速而简便的分离分析技术，由于设备简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域
广泛应用[3]。
2.1.2 离子交换层析
离子交换剂是由不溶性的高分子母体上引入可解离的基团制成的。按引入基团的交换电性不同分成阳离子交换剂和阴离子交换剂；按母体的不同可分为离子交换树脂"离子交换纤维素和离子交换凝胶。交换树脂主要用于分子量较小的物质的分离，只有某些大孔径的树脂才可用于酶的分离。离子交换的分离机理大致如下: 由于不同的蛋白质在同一pH 下会带上不同性质( 正负) 或带上不同电量的电荷，试验中可通过选择合适的pH条件，使目标蛋白和杂质带上不同性质的电荷而与离子交换剂进行相互作用，从而或保留或流出柱体; 对于与目标蛋白带电性质相同但电量不同的物质可采用不同浓度的盐溶液洗脱进一步分离。胡鹏等[4]采用离子交换层析法，对牛背最长肌中钙激活酶进行了分离纯化，并确定了最佳分离条件。
2.1.3 吸附层析
附层析利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同而实现物质的分离纯化。其是一种应用最早且至今仍在使用的纯化技术，在对传统的硅藻土、氧化铝、羟基磷石灰和活性碳等吸附剂进行了大量的研究之后，目前对于吸附层析的研究主要集中在对上述几种吸附剂的改性以及新型高分子吸附剂的开发上，但该技术在蛋白质分离纯化上的应用进展缓慢)吸附层析具有要求的设备简单，吸附剂来源丰富、价格低廉，操作
方法灵活等优点，其缺点是选择性差、分辨率较低。
2.1.4 亲和层析
亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一性和可逆性进行纯化分离的技术。成对互配的分子对，例如酶与底物"酶与辅酶，研究中可将任何一方作为固定相的配基偶联于不容性母体上，而对流动相中的对应分子进行分离。但是对于小分子的配基，由于空间位阻的作用使其难于与被分离物配对，因此需要在母体和配体之间加入一段连接臂，该过程称为母体的活化，现在已有活化后的母体商品出售。
2.1.5疏水作用层析
根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。其中，连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。但是疏水层析的某些洗脱条件可能导致蛋白质的变性，而且还存在不可预测性，对某些蛋白质分离效果很好，对另一些则不好。因此，近年来发展的新方法，常用硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析之后，进行疏水层析的样品不需要透析、凝胶过滤等方式脱盐。
2.1.6 高效液相谱层析(HPLC)
HPLC是一个高效快速分离化合物的方法，由于其分辨率高，速度快，重复性好，适用面广，灵活性强，灵敏度高等特点，使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。因此，它能有
效地分离各种多肽混合物，特别适用于分子质量不大的蛋白质和多肽物质的分离、纯化和鉴定，在蛋白质及多肽研究中已得到了广泛的应用。其中反相高效液相谱(RPLC)被广泛应用于分子质量不大的蛋白质分离、纯化和鉴定上，所使用的RPLC约95%是C18反相硅胶HPLC[5]。
2.1.7 电泳法
电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。电泳法按支持体的不同，可分为纸电泳、薄层电泳、凝胶电泳和等电聚焦电泳等。其中后2种方法的应用最为广泛，主要用于物质纯度的鉴别以及分子量或等电点的确定，当然也可作为分辨率很高的分离方法。由于电泳法的进样量少，一般更多的作为一种分离分析方法。常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳在纯化蛋白的方面也得到了很好的应用[6]。翁瑜等[7]用双向凝胶电泳比较3种常用蛋白质提取方法可以看出双向凝胶电泳的效果更好。
2.2 新型技术
2.2.1 亲和超滤
亲和超滤技术是把亲和层析的高选择性和超滤技术的高处理能力相
结合的一种新型能大规模进行生物特征物质分离提纯的技术。其基本原理为[8,9]：当需提纯的物质(亲和体)自由的存在于提取液时，由于其分子量较小，能顺利通过截留分子量大的超滤膜。但当亲和体与具有结合能力的大分子配体混合，形成亲和体-大分子配体复合物后，由于此复合物分子量远大于超滤膜的截留分子量，从而被截留；而提取液中其它未被结合的组分则通过超滤膜，从亲和体-大分子配体复合物中分离出来。当所有的杂质去除后，用合适的洗脱液处理超滤膜截留得到的复合物，使亲和体从大分子中解吸出来；游离的亲和体(蛋白质、酶等)可通过超滤膜，从大分子配合体中分离出来。透过液可被截留分子量较小的超滤膜进行浓缩；而大分子配体经再生后可循环使用。这一过程已成功地应用于蛋白质、酶等的间歇、半连续和连续操作[10]。
2.2.2 内含肽介导的蛋白质亲和纯化
传统的亲和纯化技术由于受到成本、消除亲和标签等的限制，在大规模的工业生产中较难以发挥作用，因此如何降低蛋白质亲和纯化的成本也就成了人们研究的一个重要方向。而内含肽介导的新型蛋白质纯化方式正切合了这种需要，相关的研究也越来越受到人们的重视。修饰后的内含肽能介导N-端或C-端单侧肽键断裂，与蛋白质亲和纯化技术联合应用，为重组表达的活性蛋白提供了良好的分离纯化途径，使传统的亲和层析技术有了重大突破[11]。内含肽介导的新型蛋白质纯化方式包括：
1）自切割亲和纯化
自切割亲和纯化方式就是利用内含肽具自切割特性的这种特性而实现目标蛋白与亲和标签分离的目的的。首先将编码亲和标签、内含肽及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标
签-内含肽-目标蛋白的三联体，再利用固定在树脂上的配体吸附三联体的标签而截留融合蛋白，随后在某些简单的理化因素作用下(如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入)该三联体从内含肽的N- 端或者C- 端发生自切割释放目标蛋白，而此时标签则留在了树脂表面[12]。与传统