为了评估家庭自酿葡萄酒的安全性，选取不同品种的原材料葡萄以及不同加工工艺（白糖、葡萄酒酿酒酵母的添加）酿制的葡萄酒，运用酒精计法、微生物培养法、PCR等方法对自酿葡萄酒的酒精度、pH值、酵母菌含量、细菌总数及致病菌等指标进行检测，根据国家标准对其安全性进行了评价。结果表明，选取不同品种的原材料葡萄以及不同加工工艺自酿的葡萄酒各项指标均符合国家标准，无安全隐患。实验结果发现选取无破损的云南夏黑葡萄，分两次加糖，发酵两个月以上酿制的葡萄酒具有理想的理化指标以及卫生指标。该研究结果为家庭酿制葡萄酒提出指导意见，弥补了自酿葡萄酒的工艺缺陷以及检测环节的缺失带来的潜在危害，使人们在享受自酿葡萄酒的同时保障自身的健康。
标签：家庭自酿葡萄酒；葡萄品种；酵母菌；细菌总数；醋酸杆菌；发酵；pH值；大肠杆菌；聚合酶链式反应（PCR）
1 引言
葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，含有一定酒精度的发酵酒
[1]。如今，越来越多的家庭在自酿葡萄酒。然而，近日有媒体报道称“自家酿制的葡萄酒含有杂菌会使人中毒” [2]，引起了人们对自酿葡萄酒安全性的忧虑。
本实验研究了不同原材料葡萄品种（家庭酿酒常用的6种鲜食葡萄）与加工工艺（糖、酵母的添加方法）对自酿葡萄酒安全性的影响。本实验采取酒精计法、平板计数法、PCR等方法对自酿葡萄酒的酒精度、pH值、酵母菌含量、细菌总数及致病菌等指标进行检测，评价自酿葡萄酒的安全性。进而总结减少自酿葡萄酒中的有害杂菌的制作工艺，为家庭酿制葡萄酒提出指导意见。
2 实验器材
（1）材料、试剂：葡萄；白糖；安琪牌葡萄酒专用酵母；塑料瓶；玻璃密封罐；细纱布；阳性对照菌株大肠杆菌（Escherichia coli）。1×TE缓冲液；2×Taq PCR Mix；1×TAE缓冲液；DNA Marker DL2000；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；ddH2O；葡萄糖；琼脂；酵母提取物；NaCl；胰蛋白胨等。
（2）仪器：pH计；生化培养箱；高压湿热灭菌锅；微量移液器；旋涡混合器；涂布棒；培
养皿；锥形瓶；Veriti PCR仪；SBE6003电泳仪； GL200凝胶成像系统；Centrifuge 5418高速离心机。
3 实验方法
3.1 制作葡萄酒
称取400g葡萄，洗净后，将表面的水分沥干，将葡萄一个个捏开，但不剥皮，置于干净干燥的玻璃容器里，占据容器的八成满。然后加入40g白糖，充分混匀，密封容器。
3.2 研究问题与分组
问题一：探究葡萄品种对自酿葡萄酒的影响。分别用不同种鲜食葡萄（巨峰、玫瑰香、户太八号、云南夏黑、马陆一号、马陆二号）制作。
问题二：探究酿酒酵母的添加对自酿葡萄酒的影响。
（1）不添加酵母；（2）添加酿酒酵母1.0g。
问题三：探究加糖方式对自酿葡萄酒的影响
（1）二次添加：在装入葡萄时添加20g白糖，发酵3天再20g白糖；（2）一次添加：在装入葡萄时一次添加40g白糖；（3）不加糖。
注：如无说明，各组均使用巨峰葡萄；不添加酿酒酵母，一次加糖。
3.3 平板计数法测定自酿葡萄酒的微生物含量
通过微生物平板计数法，待葡萄酒发酵1个月后检测各组自酿葡萄酒酵母菌、醋酸杆菌以及细菌总数，检测方法按相关标准执行[4，6，7]。
3.4 PCR检测自酿葡萄酒样品中的大肠杆菌
3.4.1 引物的设计与合成
大肠杆菌分别根据Phoa和Alr基因序列设计引物，参考文献[8]、[9]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
3.4.2 DNA模板的制备
（1）阳性对照DNA模板的制备。取50μL 1×TE缓冲液于灭菌的EP管中，用灭菌的牙签挑取单菌落于EP管中，混匀。将混合液于100℃的水浴锅中变性10min后，12000r/min离心8min，取0.4μL上层清液作为PCR模板，4℃保存备用。
（2）葡萄酒样本DNA模板的制备。葡萄酒样品通过棉花过滤，取滤液1mL于灭菌的EP管中，12000r/min离心8min，弃上清，留沉淀，按前述的DNA模板制备方法制备模板。
3.4.3 检验样品的设置
选取发酵1个月以上采取不同的制作工艺的葡萄酒共7种进行大肠杆菌检测，分别采用Alr与Phoa 引物进行特异性扩增。
3.4.4 PCR反应条件及其产物分析
PCR反应条件根据参考文献[8]进行调整：PCR反应体系为20μL，其中10.0μL 2×Taq PCR Mix，上下游引物各0.4μL（10μmol/L），5μL 模板DNA，其余为无菌水，94℃预变性7min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min。取5μL PCR扩增产物，以DNA Marker作相对分子质量指示，用1.0%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/mL）
在140V电压下电泳20min，置凝胶成像系统中进行结果分析。
3.5 理化指标测定
待葡萄酒发酵1个月后，测定各组酒精度及pH值，以了解发酵的程度。
4 结果
4.1 定性研究
4.1.1 醋酸杆菌
发酵两周后，部分葡萄酒的液面上层浮着一层白的菌膜。在对有白菌膜的葡萄酒进行培养后，在醋酸杆菌的培养基上均出现了清圈。
4.1.2 枯草芽孢杆菌
在部分LB培养皿上面出现了符合枯草芽孢杆菌特征的菌落。4.2 原材料葡萄种类对葡萄酒的影响
（数据略）
4.3 酿酒酵母的添加对葡萄酒的影响
（数据略）
4.4 加糖方式对葡萄酒的影响 （见表1）
4.5 酿葡萄酒大肠杆菌PCR检测结果
4.5.1 引物Alr电泳图（见图1）
4.5.2 引物Phoa电泳图（图2）
5 分析与结论
通过4.1.1中的平板培养，发现部分葡萄酒上层漂浮白菌膜是由于葡萄酒被空气中的醋酸杆菌感染。醋酸杆菌的生长会将乙醇氧化为乙酸，因此被认为是一种腐败微生物。被感染的葡萄酒逐渐失去酒香，产生强烈的挥发性酸味。通过4.1.2中的平板培养，发现枯草芽孢杆菌数
量与葡萄的品质有直接联系。业已证明，枯草芽孢杆菌一般来源于土壤[3]。由此，可推断散葡萄在采摘时接触到了土壤，从而葡萄表面携带了枯草芽孢杆菌。另据有关研究[3]，其存在不会影响葡萄酒的口味，仅会使葡萄酒产生沉淀和浑浊。
（1）原材料葡萄种类对葡萄酒的品质有重大影响。在六种常见的鲜食葡萄中，马陆一号与云南夏黑的酸度较低（pH 3.22，3.17）；巨峰葡萄的酒精度最低（5.3%（v/v） ），而云南夏黑最高（13.5%（v/v） ）。 不同的葡萄品种的微生物含量差异非常显著。其中，户太八号有着最高的酵母菌含量（4.0×108 CFU/mL），马陆一号有着最低的酵母菌含量（1.0×107 CFU/mL）。（2）酿酒酵母的添加对葡萄酒的理化指标影响较小，但对葡萄酒的微生物含量有较大影响。酵母的添加对葡萄酒的酸度无显著影响，但使酒精度上升约5%。添加酵母的葡萄酒微生物落中酵母菌的比例有很大提升，同时使细菌总数上升了10倍以上。（3）加糖方式对葡萄酒品质的影响较大。不加糖的葡萄酒的酸度较大，分批加糖对葡萄酒的酸度无显著影响。随着加糖的次数的增加，酒精度上升。随着加糖次数的增加，酵母菌数量小幅减少，细菌总数大幅减少。
通过PCR检测大肠杆菌，选择不同原材料及制作工艺酿制的葡萄酒均为阴性结果，表明各组
自酿葡萄酒含有的大肠杆菌数量均未达到PCR检出限（1CFU/mL）[8，9]，符合国家葡萄酒致病菌检测限（3个/mL）的标准[1]。
根据实验数据得出较科学合理的家庭葡萄酒制作工艺：选取无破损的云南夏黑葡萄，分两次加糖，不添加酿酒酵母，发酵两个月以上酿制的葡萄酒，具有理想的理化指标以及卫生指标。自酿葡萄酒具体推荐酿造工艺及注意事项如表2所示，以此为家庭酿造葡萄酒提供参考意见。
参考文献：
[1]GB 15037-2006 《葡萄酒》.
[2]郭铁，赵吉翔.危险的自制食品：产生毒素难去除 杂菌菌落易超标.
如何制作葡萄酒[3]福杰桑.葡萄酒酿造微生物学——实验技术与规程 （Wine Microbiology--Practical Applications and Procedures）[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
[4]GB 4789.15-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》.
[5]李莹，王世平.自酿葡萄酒生产工艺及过程中的质量控制研究[J]. 食品安全质量检测学报，2015（09）.
[6]李华，刘延琳，王华.葡萄汁和葡萄酒微生物分析（微生物的监测，分类和计数）国际标准[J].酿酒，1999（04）：61-69.
[7]GB 4789.2-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》.
[8]马冬，宋宏新，李明亮等.PCR检测乳品中大肠杆菌的研究[J]. 食品科学，2009，30（04）：260-263.
[9]许一平.多重PCR检测沙门菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的研究[D].华中农业大学，2006.
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