免疫荧光非特异性染的消除方法
一、非特异性染的主要因素
  组织的非特异性染的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
  （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
  （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
  （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
  （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
戚蓝伊  （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染。
  （6）荧光素不纯，标本固定不当等。
  二、消除非特异性染的方法
  消除荧光抗体非特异性染的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
  （一）动物脏器粉末吸收法
  常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
  肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
  用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐
水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
  【肝粉的制法】
  （1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
  （2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
  （3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
  （4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
  （5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
  （二）透析法
  荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
  （1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
  （2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
  （三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
  除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章　。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，
分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
  若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
  如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
  （四）DEAE纤维素柱层析法
  标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：
  DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：
  （1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无或淡绿液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：
  0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。
  0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。
  0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。
  将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
市场价格在有些情况下（如对市场物品）可以近似地衡量物品的价值，但不能准确度量一个物品的价值。三者的关系为：  （2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。