•2508 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年5月第36卷第5期CJTCMP，May2021，Vol.36, No.5
线粒体D N A拷贝数的影响
杨艳敏，张克交，张彦栋，徐美玲，周建玲，庄馨瑛
(云南中医药大学中药学院，昆明650500)
摘要：B的：探讨荜茇宁（GBN >和胡椒碱（PIP )对胰岛素抵抗（IR>大鼠肝脏与肌肉线粒体DNA (r^UNA)拷贝数和糖脂代谢的影响方法：采用高脂伺料喂养配合高脂乳剂灌胃，同时按每周5m g/M注射S T Z
的方法诱导IR大鼠模型、每4周检测各组空腹血糖（FBG)、血清甘油•：酯（TG)情况，连续给药8周后进行糖耐
量实验（O G T T )、检测血清胰岛素（F IN S )含量并计算胰岛素抵抗指数（H O M A-IR )给药8周后，采用R eal-tim e
P C R检测大鼠肌肉和肝脏m tD N A拷贝数和骨骼肌P G C-丨a m R N A表达水平的变化结果：G B N和P IP均能敁著降低I R
模型大鼠血清T(;、FBG、IN F S水平和(PcO.05，尸<0.0丨），》.箸改善葡萄糖|ifit异常情况（P<0.01 )。m
模型大鼠肝脏与肌肉细胞m tD N A拷W数均减少，各药物组均能抵抗这种抑制作用；高剂fit的(;BN和P IP能增加肌肉
m tD N A的拷贝数（/V0.05, P<0.01)，并且增加肌肉PGC-la niR N A表达（P<0.05) ;I M P能增加肝脏m lD N A拷贝数
(P<0.05. /><0.01) 结论：GBN和PIP能够明©改善IR模型大鼠的糖脂代谢异常状况；同时增加IR模型大鼠肌肉
m tD N A拷贝数和P G C-丨a m R N A表达，改善线粒体功能
关键词：胡椒碱；荜茇宁；胰岛素抵抗；糖脂代谢；线粒体DNA拷贝数；P fX-la
基金资助：国家然科学基金项R(No.81560672) ,s：南酋应用基础研究计划项B(N〇.2013FZ090)，云南
省创新团队计划（N〇.20I7HC011)，云南省教育厅科学研究基金项B(No.20l9Y03：i3)，云南省科技厅-云南中
医学院应用基础研究联合专项资金项0(N〇.20I9FF002-053 )
Effects of piperine and piperlonguminine on glucolipid metabolism and
mtDNA copy number in insulin resistance rats
YANG Yan-min,ZHANG Ke-jiao,ZHANG Yan-dong,XU Mei-ling,
ZHOU Jian-ling,ZHUANG Xin-ying
(College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Chinese Medicine. Kunming 650500, China )
Abstract! Objective: To investigate the effects of Piperlonguminine (GBN) and piperine (PIP) on mitochondria DNA (mtDNA) copy number and glucolipid metabolism in liver and muscle of rats with insulin resistance (IR). Methods: High-fat
diet was fed with intragastric administration of fat emulsion, and regular injection of STZ according to the amount of 5mg/kg per
week to induce IR rat model. The fasting blood glucose (FBG) and serum triglyceride (TG) were measured every 4 weeks, and
the glucose tolerance test (OGTT) was performed 8 weeks after continuous administration to evaluate the model and drug efficacy
by detecting serum insulin (FINS) content and calculating the insulin resistance index (HOMA-IR). After 8 weeks, changes in rat
muscle and liver mitochondrial DNA copy number and skeletal muscle PGC-1 a mRNA expression were measured by Real-time
PCR. Results: GBN and PIP significantly reduced serum TG, FBG, INFS and HOMA-IR levels in IR model rats (P<0.05, P<0.0\),
and significantly elevate the glucose tolerance (P<0.01). Meanwhile, the mtDNA copy number in muscle of IR rats was decreased;
high dose of GBN and PIP treatment enhanced the mtDNA copy number (PcO.OS, P<0.01) and skeletal muscle PGC-1 a mRNA
expression (P<0.05); PIP treatment enhanced the mtDNA copy number in liver (^O.OS, ^O.Ol). Conclusion: GBN and PIP could
significantly ameliorate the abnormal metabolism of glucolipid in IR model rats. At the same time, increase the mtDNA copy
number and PGC-1 a mRNA expression of IR rats and improve mitochondrial function.
Key words! Piperine; Piperlonguminine; Insulin resistance; Glucolipid metabolism: Mitochondrial DNA copy number;
PGC-1 a
通信作者：庄馨瑛，云南省昆明市呈贡区雨花路1076号云南中医药大学中药学院，邮编：650500，K-mail: ************************
中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年5月第36卷第5期CJTCMP，May 2021，Vol.36, No.5•2509 •
F u n d i n g:National Natural Science Foundation of China (No.81560672)，Natural Science Foundation of Yunnan
Province (N〇.2013FZ090), Science and Technology Innovation Group of Yunnan Province (N〇.2017HC011), Science Research
Foundation of Yunnan Education Department (N〇.2019Y0333), Yunnan Provincial Science and Technology Department: Applied
Basic Research Joint Special Funds of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine (N〇.2019FF002-053)
姨岛素抵抗（insulin resistance,IR)在肥胖和2型 糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)等代谢综合征 的发病机制中起重要作用m。越来越多的研究证明，摄人高热量饮食会导致糖代谢紊乱和胰岛素敏感性 受损，从而增加代谢异常的风险|21。目前糖尿病 和IR的临床药物包括磺脲类、二甲双胍和噻唑烷二酮 类，都有一些不良反应，如体质量增加和低血糖1V51。
线粒体主要负责以二鱗酸腺昔（adenosine triphosphate，ATP)的形式向细胞提供能量，并在许 多细胞过程中发挥重要作用。线粒体功能障碍与IR 的关系已在糖尿病患者和动物模型中观察到|f i|，且 线粒体
含量降低通常与线粒体功能受损有关。线粒 体功能障碍会诱导活性氧生成增多及氧化应激，致 使细胞内游离脂肪酸、脂肪中间代谢产物堆积m, 降低了脂肪细胞对胰岛素的敏感性，抑制胰岛素信 号转导' 最终导致T2DM的发生。由此推测，改善 线粒体功能和生物发生可能有助于和预防IR和T2DM〇
天然产物被认为是发现抗T2DM药物的重要来 源|91。许多天然化合物如黄烷醇111)1和花青素1111已被 报道通过不同的信号途径改善IR。白藜芦醇作为一 种氧化还原活性化合物可通过对抗活性氧来改善线 粒体功能和生物合成|121。革麦宁（piperlonguminine, GBN)和胡椒喊（piperine，PIP)作为中、蒙医常用药 材荜茨尸批/" /cwgww L.的主要有效成分，同样具有抗 氧化的作用|13|；此外，P1P还具有抗惊厥、抗肿瘤|131、降血脂|141、降血压|151、免疫调节1〜、促进药物吸收代 谢[1'降低IK大鼠血糖和增加胰岛素敏感性等作 用，而GBN由于其良好的降脂功效和低毒性已经成 为国家重大新药创制专项的候选药物|I I M91。本研究 基于现今IR的现状，充分发挥中医学慢性 疾病及代谢类疾病的优势，从中药荜茇中提取活性 成分P1P和GBN，用于高脂高糖高盐诱导的糖脂代谢 紊乱丨R大鼠，探讨GBN和PIP对IR大鼠糖脂代谢和肝 脏与肌肉线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数的影响，挖掘荜茇生物碱在代谢类疾病方面 的应用价值。
材料
I.动物SPF级健康雄性SD大鼠120只，8周龄，体质量（180±20)g，由成都达硕实验动物公司提供，生产许可证号：SCXK(川）2013-24，合格证号：0014842，批号：0018170。词养温度为（23±1)^：，相
对湿度为40%〜60%，在光照和黑暗各12h交替条件
下进食和饮水。
2. 药物PIP购自西安天本生物工程有限公司，批号：TBP130312，经分析鉴定，纯度为98%。GBN
由本课题组合成，经分析鉴定，纯度为98%。罗格
列酮片（R0G)购于成都恒瑞制药有限公司，规格：
4mg/片，批号：H20030569。临用前以0.9%氯化钠
溶液按照设定浓度稀释，置4T冰箱备用，灌胃前
放至室温并混匀。盐酸二甲双胍片（MET)购于中
美上海施贵宝制药有限公司，规格：〇.5g/片，批号：
H20023370，处理方式同R0G。链脲佐菌素（STZ)购
于广州康龙生物科技有限公司，规格：l〇〇mg/瓶，批
号：18883664，取STZ 100mg，溶于10mL柠檬酸钠缓
冲液，调其pH值为4.5。
3.试剂0.9%氯化钠溶液（贵州天地药业有 限公司，批号：H13082809)，75%乙醇溶液（昆明
力健消毒制品有限公司，批号：130810)，吐温-80
(天津市化学试剂三厂批号：130720)，甘油三酯 (triglyceride,TG)试齐I J盒（中生北控生物科技股
份有限公司，批号：146530)，胰岛素ELISA试剂盒
(上海沪峰生物科技有限公司，批号：20140401A);
DNA提取试剂盒（Biomiga生物技术有限公司，货号：
GD2211-02)，Trizol(Amhion公司，批号：229010)，
逆转录试剂盒（Promega北京生物技术有限公司，批
号：0000393483)，Go Taq qPCR Master Mix(Promega
北京生物技术有限公司，批号：0000340492)。
4.仪器SP-756型紫外可见分光光度仪（上海 光谱仪器有限公司），DNM-9062G型酶标仪（北京普
朗新技术有限公司），TGL-16B型台式离心机（上海
安亭科学仪器厂），移液（德国BRAND公司），三
诺安稳血糖仪/血糖试纸（长沙三诺生物传感技术股
份有限公司），PT124S型电子天平（梅特勒托利多仪
器上海有限公司），涡旋混合仪（江苏海门市其林贝
尔仪器制造有限公司），定量采血管（南通福利来医
疗器材有限公司），Real-time PCR仪（罗氏公司）。
方法
1.分组、造模及给药120只大鼠适应性喂养1
周后，分为2批，每批60只；各批又随机分为正常组
10只，高脂饮食组50只，正常组给予普通饲料（购于 云南中医药大学动物房），高脂饮食组给予高脂词料 (高脂饲料的质量比为：基础饲料57%、糖25%、猪
油17%、盐1%，由本课题组实验室加工而成）。喂养 标准为每只60g /d ，且每3天用高脂乳剂（高脂乳剂： 适量猪油在80T 水浴加热，按猪油与胆固醇10 : 3的 比例充分搅拌溶解；加人适量吐温-80，搅拌至乳液 充分乳化；最后缓慢加人适量温水稀释，即成为稳 定的高脂乳剂；配制好的高脂乳剂保存于-20T 冰箱 中备用，灌胃前于80丈水浴中加热融化，凉至不烫手 后按所需剂量给予大鼠灌胃）按10mL /kg 灌胃1次， 每周按5mg /kg 剂量给予STZ 腹腔注射1次，注射STZ 后，大鼠给予20%蔗糖水饮用以防发生低血糖:，采取 自由饮水，定时定量喂词，每周称重1次。造模4周后 取血，检测空腹血糖是否异常升高，判断造模情况。 第一批造模成功的大鼠再随机分为5组：模型组， ROG 组（3mg /kg ), PIP 低、中、高剂量组（15、30、 60mg /kg )，每组10只；第二批造模成功的大鼠也随机 分为5组：模型组，MET 组（150mg /kg ), GBN 低、中、 高剂量组（5、10、20mg /kg )，每组10只，各组持续给 予相应药物8周。
2.
样本收集末次给药结束后，大鼠禁食不 禁水12h ，摘眼球取血并处死。血液3 000r /min 离心 lOmin ，
分离血清。取肝脏、肌肉组织样本存于-80^ 超低温保存箱备用。
3. 观察指标及其测定方法3.1
空腹血糖（fasting blood glucose , FBG )的
检测每隔4周（0周、4周、给药4周、给药8周），各组 大鼠禁食不禁水12h ，采用大鼠尾尖取血，血糖仪检
测 FBG 。
3.2葡萄糖糖耐量（oral gl u cose tolerance test , OGTT )的检测给药8周后，以FBG 为基础，以浓度 为250g /L 的葡萄糖溶液（2g /L )灌胃后，分别于0、
1、211测定血糖，计算2h 餐后血糖（postprandial W ood glucose , PG )下降率。2h PG 下降率（％) = (lh BG -2h BG)/lh BGxlOO %。3.3 空腹胰岛素（fasting insulin , FINS )水平 检测和膜岛素抵抗指数（insulin resistance index , HOMA-IR )的计算取已分离血清，采用酶联免疫 (ELISA )法测定FINS ，并计算肋1^八-111〇110\1入- IR=FPG (mmol /L ) x FINS (mIU /L ) /22.5〇
3.4血清TG 含量的检测取已分离血清，按照 TG 试剂盒说明书操作步骤，测定TG 。
3.5肌肉和肝脏mtDNA 拷贝数和肌肉PGC-ict
mRNA 表达的检测米用Keal-time PCR 法，按照 Biomiga 提取试剂盒说明书提取大鼠肝脏和肌肉 DNA ，以线粒体编码基因细胞的拷贝数作为mtDNA 拷贝数，为减少不同组织DNA 模板量的差异，以HBB 作为内参；采用Trizol 法提取大鼠肌肉总RNA ，按照 试剂盒操作进行反转录，转录后的产物进行PCK 扩增，以P -actin 作为内参，米用SY'BR green I 染料 法，PCR 反应条件为（95^ 10min —95T ； 15s —55丈 30s —72t 30s )，所有PCR 均采用3个复孔进行，采用 A ACT 法计算各目的基因的相对表达M 。反应引物 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，基因引 物序列见表1。
表1
引物序列
基因基因序列引物（5’^3’）产物长度 (bp )
mtDNA
NC_001665.2
F ： TCT CGA TG
G TAA CGG
GTCT H ： ACG GCT ATG TTG AGG A AG G
100
HHB NC_005100.4F ： GCT GOT TGT CTA CCC TTG GA R ： GGC GTT TAT CAC CTT CTT GC
118
FGC-la
NM_031347.1
F ： ACT GA
G CTA CCC TTG GGA TG R ： TAA GAA TTT CGG TGG TGACA
112
p-actin
NM_031144.3
F ： ACA GGA TGC AGA AG
G AGA TTA C R ： ACA GTG AGG CCA GGA TAG A
117
4.统计学方法采用SPSS 1
5.0统计软件，各组 数据均以表示，组间比较用单因素方差分析，组 内前后比较用配对比较的凇验。以P <〇.〇5为差 异有统计学意义。
结果1. 大鼠一般情况正常组大鼠被毛光泽，精神 良好，食欲正常，对外界反应正常。模型组大鼠毛 枯燥松散，无光泽，自发活动减少，对外界刺激的敏
感性下降，大便较正常组稀溏，明显出现三多（多 尿、多饮、多食）症状。各组大鼠给药后三多症 状均有一定程度改善，毛较模型组润泽，自发活动 增多，对外界的刺激较敏感。词养过程中各组大鼠无 死亡。
2. P 1P 、GBN 对IR 模型大鼠FBG 的影响见表2- 表3。造模4周后，与正常组比较，其余各组大鼠FBG 均显著升高（户<〇.〇丨，P <〇.〇5)；给药4、8周，与模型
图1 P IP 对大鼠2h P G 下降率的影响U±5，，《=10)
注：与正常组比较，><0.05, "P <0.01；与模型组比较， A P<0.05, A A P<0.01。下图同。
图2 G B N 对大鼠2h P G 下降率的影响（i±5, w =10)
4. PIP、GBN 对IR 模型大鼠FINS 和HOMA-IR 的
影响见表6-表7。与正常组比较，模型组大鼠的 FINS 和HOMA-IR 水平显著升高（P <0.05)；与模型组 比较，两阳组，PIP、GBN 各剂量组大鼠FINS 和 HOMA-IR 水平均显著下降（P <〇.〇5)。
表6 P IP 对大鼠FIN S 和H ()M A -1R 的影响（f ±s ，w =10)组别FINS(mIU/L)HOMA-IR 正常组22.32±4.82 4.09 ±1.26模型组
30.31 ±4.27* 6.96 ±1.27*ROG 组23.48 ±4.62a 4.68±1.25a P1P 低剂量组25.50 ±6.93a 5.17±1.64a PIP 中剂量组
25.72 ±5.83a 5.16±1.47a p ip 高剂量组
25.48 ±4.37a
4.96±1.13a
注：与正常组比较，><〇.〇5；与模型组比较，A P <0.05下表同:
表5 G B N 对大鼠O G T T 的影响（7±^，《=10, m m ol/L ) 组别 O h
lh
2h
正常组 4.95 ±0.18 6.71 ±0.33 5.41 ±0.10模型组
6.51 ±0.26
7.32 ±0.407.05 ±0.34*MET 组 5.60 ±0.27 6.24 ±0.40 5.60 ±0.09GBN 低剂量组 6.17±0.30 6.74 ±0.21 5.89 ±0.23CJBN 中剂量组 5.72 ±0.22 6.24 ±0.33 5.61 ±0.15GBN 高剂量组
5.37±0.26
6.20 ±0.41
5.61±0.11
组比ROG 组，MET 组，PIP 、GBN 各剂量组FBG 均 显著降低（P <〇.〇l ，P <〇.〇5)。
表2 P IP 对大鼠F B G 的影响（1±夂w =10, m m ol/L )组别
造模前
造模4周
给药4周给药8周
正常组 模型组 R O G 组
PIP 低剂量组云南省昆明市邮编
PIP 中剂量组
PIP 高剂量组
4.36 ±0.66
4.64 ±0.61 4.57 ±0.444.64 ±0.50
4.22±0.18
6.04 ±0.45” 5.04±0.31“ 5.06 ±0.42“
4. 31 ±0.29 6.09 ±0.27“
4.39±0.36a 4.66±0.24a
4.47±0.50
5.05±0.22
4.52±0.32A
4. 07±0.39 6.14±0.25“
4.44±0.32aa 4.51±0.24aa 4.47±0.27aa
4.27±0.51
5.06±0.28” 4.58±0.34A A 4.35±0.25A
注：与正常组同期比较，><0.05, ”P<0.01；与模型组同期比 较，^<0.05, A A /5<0.01。表3-表5同。
表3 G B N 对大鼠F B G 的影响《=10, m m ol/L )组别
造模前
造模4周
给药4周
给药8周
正常组 5.52 ±0.31 5.13 ±0.23 4.99 ±0.22 4.95 ±0.18模型组 5.21 ±0.54
5.97 ±0.54“
6.16 ±0.74" 6.51 土 0.26"MET 组 5.32 ±0.47 5.43±0.51’ 5.30 土 0.39^ 5.60 土 0.27^G 酬氐
剂量组
5.38 ±0.25 5.41 ±0.34. 5.87±0.32a
6.16 ±0.3#GBN 中
剂量组
5.37 ±0.27
5.29士0.41_ 5.39±0.52a 5.72±0.22aa GBN 高 剂量组
5.27±0.90
5.34 ±0.26’
5.39±0.35aa
5.37±0_26aa
3. PIP 、GBN 对1R 模型大鼠OGTT 的影响见表
4-表5，图1-图2。当给予外源性葡萄糖时，正常组 血糖迅速上升，lh 达峰值，2h 后血糖回落至正常水
平。而模型组lh 血糖迅速上升，2h 后仍处于高血糖 状态。在2h 时，与正常组比较，模型组血糖显著升高 (/V 0.01)。模型组、两阳组和H P 、GBN 组大鼠 血糖值在口服葡萄糖后lh 达峰值，之后血糖值逐渐 降低，但不能降至空腹水平。两阳组和PIP、GBN 组2h P G 下降率均显著高于模型组（P 〈〇.〇l )。
表4 P IP 对大鼠O G T T 的影响«=10, m m ol/L )组別O h
lh
2h
正常组 4.07 ±0.39 6.22±0.58 5.48 ±0.39模型组
6.14±0.258.03±0_44
7.04 ±0.36*ROG 组 4.44 ±0.32 6.49 ±0.76 5.68 ±0.33IM P 低剂fi 组
4.51 ±0.24 6.43 ±0.60
5.63 ±0.71p ip 中剂量组 4.47±0.27
6.76 ±0.67 5.74 ±0.41p ip 高剂a
组
4_35±0.25
6.63 ±0.45
5.63 ±0.46
X
X
5-I
0-I 5H
<%)
讲镗H -o d H
Z
•2512-中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年5月第36卷第5期CJTCMP，May 2021，Vol .36, No .5
C Z
D 肌肉
_肝脏
丨冬15
PIP 对IR 模型大鼠肌肉和肝脏m 丨DNA 拷贝数的影响
阁8 GBN 对IR 模型大鼠肌肉P G C -la mRNA 表达的影响
(■^±•5,《=10)
，
，，，
丨冬丨7 P1P 对1R 模型大鼠肌肉P G C -la mRNA 表达的影响
(•▽土^1，w=10)
图6 (;BN 对IR 模型大鼠肌肉和肝脏m 丨丨)NA 拷W 数的影响
7. PIP 、GBN 对IR 模型大鼠肌肉PGC-lot mRNA
表达的影响见图7-图8。川模型大鼠肌肉PGC-la mRNA 较正常大鼠显著下降（P <0.05); PIP 和GBN 干
预后，PGC-la mRNA 表达S 著升高（P <0.05)。
图3
PIP 对1R 模型大鼠TG 的影响（J 土i', n=10)
c ，.
c »'
参
图4 GBN 对IR 模型大鼠TG 的影响（3F ±J , «=10)
6. P 1P 、GBN 对IR 模型大鼠肌肉和肝脏mtDNA
拷贝数的影响见图5-图心在肌肉上，与正常组比 较，模型组mtDNA 含量有所下降，但差异无统计学 意义；与模型组比较，两阳组均有上升趋势，但 差异无统计学意义；PIP 低、高剂量组和GBN 高剂量 组mtDNA 含量显著增加（P <0.01, /^O .OS )。在肝脏 上，与正常组比较，模型组m 山NA 含量有下降趋势， 其中PIP 模型组差异有统计学意义（P <0.05)；与模 型组比较，两阳组均有上升趋势，PIP 各剂量组 mtDNA 含量显著增加（P <0.01, P <〇.〇5)，GBN 各剂 量组有上升趋势:
表7 GBN 对大鼠FINS 和HOMA-1R 的影响（i ±i , «=10)
组別FINS(mIU/L)HOMA-IR 正常组23.47±2.90 5.16±0.94模型组32.74 ±2.64'9.53 ±0.75*Mt:T 组26.21 ±2.60a 6.71±0.84a (;BN 低剂t t 组27.68 ± 2.01A 7.61±0.67a GBN 中剂M 组25.74 ±4.83a 6.65±1.31a GBN 高剂U ：组
24.86 ± 5.19a
5.96±1.80a
5. PIP 、GBN 对IR 模型大鼠TG 的影响见图3-
图4。与正常组比较，模型组大鼠的TG 水平显著升高 (/M X 05)；与模型组比较，两阳组，P 1P 各剂量组和 (;BN 中剂量组大鼠T C 冰平显著下降（P <0.05, _P <0.01)
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