第37卷第3期2019年7月
海洋科学进展
A D V A N C E S I N MA R I N E S C I E N C E
V o l .37 N o .3
J u l y
,2019发光细菌法对北戴河湿地沉积物
遗传毒性的评价
赵昔龙1，李 倩2,3，张佳林4，林法祥2,3，高 伟2,
3，韩 彬2,3，崔志松2,3，李景喜2,3，郑 立2,
3*(1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005;
2.海洋活性物质与现代分析技术国家海洋局重点实验室，山东青岛266061;
3.自然资源部第一海洋研究所海洋生态研究中心，山东青岛266061;
4.秦皇岛海洋和渔业局，河北秦皇岛066000)收稿日期:2018-11-13
资助项目：国家重点基础研究发展计划项目  生态环境损害鉴定评估业务化技术研究(2016Y F C 0503602)；国家自然科学基金委员会-山东省人民政府联合基金项目  海洋生态与环境科学(U 1406404)；蓬莱19-3赔偿款项目
北戴河滨海湿地生物修复项目作者简介：赵昔龙(1994-)，男，山东济南人，硕士研究生，主要从事生态环境毒性评价方面研究.E -m a i l :z h a o x i l o n g
1994@163.c o m  *通讯作者：郑 立(1976-)，男，湖北武汉人，研究员，博士，主要从事海洋微生物方面研究.E -m a i l :z h e n g l i @f i o .o r g
.c n (高 峻 编辑)
摘 要：针对蓬莱19-3油田溢油事故造成的秦皇岛北戴河湿地植被退化，通过种植湿地植被碱蓬(S u a e d a s a l s a )和海韭菜(T r i g l o c h i n p a l u s t r e )对受损湿地进行修复㊂为评价修复效果，分析了8个站位在修复前(2016-11)和修复后(2017-07)沉积物中多环芳烃㊁石油烃和重金属的含量变化，同时采用发光细菌法评价其遗传毒性㊂结果显示，沉积物中多环芳烃和石油烃的含量在修复后下降明显，降解
率范围分别为82.57%~97.45%和60.99%~98.99%㊂此外，修复前多数样品表现出较强的遗传毒性，发光细菌法显示沉积物遗传毒性的丝裂霉素C (M i t o m y
c i nC ，简称MM C )的等当量浓度范围为-2.042~2.018m g /L ,4个站位为高毒，中毒和低毒的站位各有2个；修复后，沉积物的遗传毒性明显降低，其MM C 的等当量浓度范围为-0.574~0.015m g /L ，所有站位均为低毒㊂研究表明，湿地植被的修复显著提高了湿地的生态环境质量，且发光细菌法可作为快速评价湿地沉积物遗传毒性的检测方法㊂关键词：滨海湿地；湿地修复；发光细菌法；遗传毒性中图分类号:X 826    文献标识码:A    文章编号:1671-6647(2019)03-0508-10
d o i :10.3969/j
.i s s n .1671-6647.2019.03.014引用格式:Z HA O X L ,L IQ ,Z HA N GJL ,e ta l .G e n o t o x i c i t y e v a l u a t i o no fB e i d a i h ec o a s t a lw e t l a n ds e d i m e n t u s i n g
l u m i n e s c e n t b a c t e r i a [J ].A d v a n c e s i n M a r i n eS c i e n c e ,2019,37(3):508-517.赵昔龙，李倩，张佳林，等.发光细菌法对北戴河湿地沉积物遗传毒性的评价[J ].海洋科学进展,2019,37(3):508-517.
湿地是指天然或人工㊁长久或暂时性的沼泽地㊁泥炭地㊁水域地带，静止或流动的淡水㊁半咸水㊁咸水，包
括低潮时水深不超过6m 的海水水域，约占全球陆地面积的6.4%[1]
，其生态系统组成主要包括生物㊁地貌㊁气候㊁水文㊁土壤等[2]
，在调节气候㊁保护生物多样性以及调节城市生态系统功能过程中具有不可替代的作用[3]
㊂由于人类活动的影响，截至2009年底，全球湿地至少减少了33%[4],
湿地的生态环境保护亟需受到更多重视㊂
北戴河大潮坪湿地位于秦皇岛市东南部，连接新河入海口，是典型的河口滨海湿地，也是四大国际观鸟
胜地之一，其具有贮存水资源㊁净化水体㊁防止海岸侵蚀和维持物种多样性等重要作用[5-6]
㊂受2011年渤海蓬莱19-3溢油事故的影响,
湿地部分区域植被退化严重㊁生物多样性降低[7]㊂林法祥等[8]
前期调查表明，湿地中多环芳烃含量为高度污染水平㊂现通过一段时间的种植湿地植物修复受损湿地㊂需要检测湿地内污染
3期赵昔龙，等：发光细菌法对北戴河湿地沉积物遗传毒性的评价509物含量变化并评价湿地修复前后沉积物的遗传毒性㊂
目前，遗传毒性的检测方法主要有A m e s试验㊁S O S/u m u实验和发光细菌法[9-10]㊂A m e s试验和S O S/ u m u法所用的鼠伤寒沙门氏菌(S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m T A1535)具有致病性且操作复杂[11-12]，相比较而言，发光细菌法更为快速㊁灵敏㊁简便㊁经济[13]㊂我们采用经遗传改造的不动杆菌G T o x菌株㊂当G T o x暴露于遗传毒性污染物后，细胞内对遗传物质损伤作出响应的基因表达被诱导而使受其调控的发光基因表达，导致细菌发光增强，发光强度与污染物的遗传毒性水平呈正相关(Pɤ0.5)，通过测定发光细菌G T o x的发光诱导率表示样品的遗传毒性大小，样品遗传毒性水平用丝裂霉素C(M i t o m y c i nC，简称MM C)的等当量浓度表示[14]㊂崔志松等[15]和栾晓等[16]已成功运用该方法分别对环渤海12个排污口水质和黄岛溢油污染海水进行检测[15-16]，但是还未见对滨海湿地沉积物遗传毒性的检测报道㊂
我们依托于秦皇岛北戴河湿地生态修复工程项目，结合对比修复前后沉积物中的化学污染物含量，并采用发光细菌法检测沉积物的遗传毒性，以期为滨海湿地的修复评价工作提供技术支撑㊂
1材料与方法
1.1样品采集
湿地植被修复区域是北戴河大潮坪滨海湿地，位于秦皇岛市鸽子窝公园以北，滨海大道东侧，新河河口以南区域，面积约为7.3ˑ104m2，采样站点按照棋盘法在修复区域布设8个点(图1和表1)㊂
图1北戴河湿地采样站位(һ)区域分布示意图
F i g.1 D i s t r i b u t i o no f t h e s a m p l i n g s i t e s(һ)i nw e t l a n do fB e i d a o h e
表1样品站位坐标
于2016-11-16和2017-7-20分别采集1次样品：用不锈钢铲子采集表层沉积物样品，经锡箔纸包装后装入密封袋,-20ħ冷冻保存，带回实验室后测定有机污染物指标并评价遗传毒性；用塑料铲子采集表层沉积
510海洋科学进展37卷物样品，直接用塑料袋包装,-20ħ冷冻保存，带回实验室后测定重金属指标㊂
1.2实验材料
1.2.1试剂
供试菌剂:G T o x冻干菌剂，上海合森生物科技有限公司生产㊂
人工海水：准确称取35.959g工业级海盐溶解于1L超纯水中，调节p H(7.7ʃ0.1)㊂
自制生理盐水：准确称取8.5g氯化钠溶解于1L超纯水中,121ħ灭菌15m i n，冷却至室温放置㊂
L B液体培养基:10g胰蛋白胨㊁10g氯化钠㊁5g酵母粉溶于1L超纯水中，调节p H(7.7ʃ0.1),121ħ灭菌15m i n㊂
MM C母液：称取20m g丝裂霉素C溶解于100m L人工海水，容量瓶定容至100m L，冷藏避光保存㊂1.2.2仪器设备
多功能酶标仪(美国P e r k i n E l m e r公司生产,V i c t o rX型)，自动灭菌锅(日本T o m y公司生产,S S-325型)，恒温培养摇床(上海知楚仪器公司生产,Z Q L Y-180S型),p H计(梅特勒-托利多仪器有限公司生产, F E20型)，盐度计(美国E U T E C H仪器公司生产,S A l T6+型)，漩涡振荡器(杭州米欧仪器有限公司生产, M I X-25P型)，超纯水仪(上海飞岭仪器有限公司,U n i q u e-S30型)，离心机(日本日立公司生产,C R22G型)，荧光分光光度计(美国尤尼柯公司生产,U V6100S型)，气相谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司生产,6890N G C型)，电感耦合质谱仪(美国安捷伦科技有限公司生产,7900型)
1.3分析与检测
1.3.1沉积物污染物分析
采用荧光分光光度法[17]测定石油烃质量分数㊂沉积物样品经真空冷冻干燥，称取0.3~2.0g样品置于具塞比管中，加脱芳石油醚进行超声萃取，于激发波长310n m㊁发射波长360n m处测定荧光值㊂通过标准油品建立标准曲线，计算沉积物的石油烃质量分数㊂
采用气相谱质谱法[18]测定多环芳烃质量分数㊂沉积物样品经真空冷冻干燥㊁粉碎过筛(100目)后，称取5.0g样品置于具塞锥形瓶，加入1g铜粉及20m L体积分数为V(C6H14)ʒV(C H2C l2)=1ʒ1的混合萃取剂，超声萃取15m i n，将上清液倒出；重复上述萃取操作，合并上清液㊂经旋蒸㊁过无水硫酸钠㊁滤膜净化和氮吹至1m L㊂气相谱条件：载气为高纯氦气，流量1.0m L/m i n，不分流进样，进样量为1μL，进样口温度280ħ㊂柱温箱升温程序：起始80ħ，以4ħ/m i n升到150ħ，再以10ħ/m i n升到290ħ，保持10 m i n㊂质谱条件：进样口温度280ħ，电子轰击(E I)离子源，电子能量70e V，离子源温230ħ，四级杆温度150ħ㊂
采用电感耦合等离子体质谱法(I C P-M S)[19]测定重金属质量分数㊂沉积物样品经真空冷冻干燥㊁粉碎过筛(80目)，准确称取0.10g于聚四氟乙烯高压密封罐中，加入6m Lφ(H N O3)=65%和2m Lφ(H2O2)= 30%，按表2程序进行消解；样品消解完毕，冷却㊁赶酸后用超纯水定重至20.00g，待测㊂测试标准溶
液和样品溶液时，同时加入内标溶液进行仪器校准，内标溶液为50μg/L的L i,S c,G e,Y,I n,T b,B i㊂
表2微波消解工作参数
T a b l e2 T h ew o r k i n gp a r a m e t e r s o fm i c r o w a v e d i g e s t i o n
步骤功率/W t/ħ升温时间/m i n保持时间/m i n
1150010033
2150015073
3150017053
41500190510
3期赵昔龙，等：发光细菌法对北戴河湿地沉积物遗传毒性的评价511 1.3.2遗传毒性检测
样品预处理：参照徐广飞等建立的方法[20]，各站位沉积物样品经真空冷冻干燥，取15g至三角瓶内，然后加入60m L人工海水，经25ħ㊁150r/m i n浸提0.5h后9000r/m i n离心15m i n，取上清液作为待测液㊂冻干菌剂复苏：取0.015g~0.020g发光细菌G T o x冻干菌剂，加5m L超纯水振荡摇匀30s，将混悬液转
移至离心管,300r/m i n离心2m i n，将上清液转移至另一离心管,5000r/m i n离心5m i n，弃上清液，用5 m L自制生理盐水重新悬浮,5000r/m i n离心5m i n，弃上清液，用5m LL B液体培养基重新悬浮，倒入V 型加样槽,15m i n内使用㊂
将人工海水作为阴性对照样品，并用人工海水将MM C母液依次稀释至0.02,0.10,0.20,0.50,1.00, 2.00m g/L㊂用单道微量移液器向96孔板中添加190μL人工海水㊁MM C标准溶液和待测样品，用多道可调移液器向以上微孔中快速添加10μLG T o x菌剂，立即将96孔板放入30ħ恒温培养箱中培养3h㊂设定仪器程序，将96孔板放入多功能酶标仪测试舱,30ħ控温,2m i n后检测发光强度㊂所有样品均设置3个平行㊂
样品的遗传毒性大小可以用发光诱导率表示，发光诱导率(I R)的计算公式:
I R=L-L C K
()/L C Kˑ100%,
式中,L为样品的发光强度,L C K为人工海水的发光强度㊂
当L为阳性标准样品MM C的发光强度时，建立MM C质量浓度与I R的线性相关方程:I R=a+ b C MM C㊂检验所求R2值的显著水平Pɤ0.05，将样品的发光诱导率代入此方程可计算出各个样品的MM C 的等当量浓度㊂
MM C溶液对肿瘤细胞抑制作用的数据库[21]表明,MM C溶液对肝癌细胞的最低和平均半效应浓度分别约为0.02m g/L和0.20m g/L㊂以此为标准，依据MM C的等当量浓度(C MM C)对遗传毒性进行高㊁中㊁低毒分级(表3)㊂
表3遗传毒性的分级
T a b l e3 T h e g e n o t o x i c i t y c l a s s i f i c a t i o no f s e d i m e n t q u a l i t y
C MM C/(m g㊃L-1)遗传毒性分级生物学效应
C MM C<0.02低毒不影响海洋生物的生殖系统，幼虫孵化率高，不引起幼虫的致畸
0.02ɤC MM C<0.20中毒一定程度地影响海洋生物的生殖系统，部分敏感生物幼虫的孵化率低，并引起部分敏
感生物幼虫的致畸
0.20ɤC MM C高毒较大程度地影响海洋生物的生殖系统，大部分敏感生物幼虫的孵化率低，并引起大部
分敏感生物幼虫的致畸
2结果与分析
2.1沉积物中污染物分析结果
沉积物的污染物分析中，对满足正态分布的样品数据进行t检验，对非正态分布的样品数据进行M a n n-W h i t n e y U T e s t(2-t a i l e d)检验㊂所有指标在修复前后都存在显著性差异(Pɤ0.05)㊂修复前，多环芳烃含量最低站位是Q04，最高站位是Q08，质量分数分别为448.71n g/g和4703.80n g/g；石油烃含量最低站位是Q05，最高站位是Q08，质量分数分别是1.82m g/k g和48.47m g/k g(表4)㊂
512 海 洋 科 学 进 展37卷
表4 样品的污染物分析
T a b l e 4 P o l l u t a n t s a n a l y s i s o f s a m p
高伟光个人资料简介l e s 修复前(2016-11
)修复后(2017-07
)站 位
w (
多环芳烃)
/(n g ㊃g -1)w
(石油烃)/(m g ㊃k g
-1)w (重金属)/(m g ㊃k g
-1)C r C u Z n A s C d
P b
w (
多环芳烃)
/(n g ㊃g -1)w
(石油烃)/(m g ㊃k g
-
1)w (重金属)/(m g ㊃k g
-1)C r C u Z n A s C d P b Q 01888.76
17.6815.46.1921.162.100.0558.8695.792.987.554.7213.491.460.04
7.50Q 021187.209.71
16.767.8120.762.190.06413.6876.991.3511.743.479.811.590.0247.18Q 032143.2813.0614.336.3121.631.960.05712.5576.564.056.932.227.761.520.012
6.42Q 04448.714.0714.65.0515.862.410.02212.34
78.191.2312.895.3311.671.550.01514.12Q 05602.801.8219.557.3221.582.290.04312.0177.920.7118.054.1812.861.660.0499.03Q 06570.22
6.121
7.496.3516.732.610.03513.1975.961.349.043.5811.641.970.0147.96
Q 071578.2514.3723.7228.4619.962.660.03915.5174.10
1.5923.595.1313.591.640.059.17Q 08
4703.8048.4720.378.7833.742.910.08517.80120.170.49
8.932.908.571.770.034
7.36
修复后，多环芳烃最低和最高质量分数降至74.10n g /g 和120.17n g /g
，分别对应站位Q 07和Q 08；石油烃最低和最高质量分数降至0.49m g /k g 和4.05m g /k g ，分别对应站位Q 08和Q 03；重金属整体无明显变化规律,C r 和Z n 较修复前有明显的下降，其中,C r 的最大去除率为56.16%,Z n 的最大去除率为74.60%,
除Q 04站位的P b 含量有小幅度上升外，其余站位均为下降，最大去除率为58.65%㊂
各站位的植被生物量情况(表5)显示，该湿地植被类型主要包括碱蓬㊁海韭菜和芦苇，芦苇为自然生长,
经过人工补充种植碱蓬和海韭菜㊂修复前，植被覆盖率较低,Q 06站位有少量碱蓬处于正常生长状态，其污染物含量水平略低于其它站位;Q 07和Q 08站位虽有芦苇覆盖，但大多芦苇处于枯萎状态，污染物含量水平较高㊂修复后,Q 07和Q 08站位的芦苇生物量虽有下降,
但均为新鲜植株，生长状态良好；其余站位植被数量大幅增加，污染物含量水平整体呈下降趋势㊂
表5 站位植被类型和生物量
注:
为无植被2.2 沉积物遗传毒性检测与评价
利用发光细菌对湿地沉积物遗传毒性进行检测，修复前后沉积物的发光诱导率差异性较大(图2)㊂修复前,Q 01和Q 02站位的诱导率为负值，且绝对值较大;Q 03~Q 08站位对G T o x 均表现明显的诱导
发光作用，其发光诱导率的范围为20.57%~97.08%，诱导率最高和最低站位分别为Q 05和Q 03㊂分析出现
上述情况的原因是Q 01和Q 02站位存在较高的急性毒性，影响了G T o x 菌株活性,
从而出现较强烈的抑制