19种中草药美白及抗氧化活性的比较
王雪梅;沈雪梅;吴文琴;张娜;王荣庆
【摘 要】以无水乙醇和水作为萃取剂超声提取19种中草药,采用紫外-可见分光光度法测试各中草药提取液对酪氨酸酶和DPPH·、·OH、·O-23种自由基的抑制率及半数抑制浓度IC50.结果表明,茯苓、黄芩、红景天、赤芍、人参、白蔹均表现出较强的酪氨酸酶抑制活性,其中茯苓对酪氨酸酶的抑制能力最强.红景天、黄芩、白芍、赤芍的综合抗氧化活性强于其他中草药.%Absolute ethyl alcohol and water were used to extract 19 kinds of Chinese herbal medicine with ultrasonic extraction,the inhibition ratio and the half inhibition concentration on tyrosinase and three kinds of radical of DPPH·,·OH and ·O-2 were determined by UV-visible spectrophotometry.The results showed that extracts of poria cocos,scutellaria baicalensis,rhodiola rosea,radix paeoniae rubra,ginseng and ampelopsis japonica showed a strong inhibitory effect on the tyrosinase,in which poria cocos was the strongest,while the extracts of rhodiola rosea,scutellaria baicalensis,radix paeoniae alba and radix paeoniae rubra had stronger comprehensive antioxidant activity than the other herbs.
【期刊名称】《安徽大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(041)001
【总页数】9页(P86-94)
【关键词】中草药;酪氨酸酶;自由基;抗氧化活性;抑制率
【作 者】王雪梅;沈雪梅;吴文琴;张娜;王荣庆
【作者单位】安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230601;安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230601;安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230601;安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230601;安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230601
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ658;R285
皮肤中黑素的数目、大小、类型及分布影响着人体皮肤颜.黑素是由黑素细胞内的酪氨
酸在酪氨酸酶、多巴素互变酶，5,6-二羟吲哚-2-羧酸氧化酶(TRP-1)的综合作用下形成的[1].由黑素的合成途径可知，酪氨酸酶在黑素产生过程中起着至关重要的作用[2]，其活性过高或异常表达会引起黑素生成过多，并引发皮肤素性疾病[3-4]；此外，机体在代谢过程中产生的具有高活性的自由基对黑素的合成也有着重要的影响[5].体内的氧自由基产生过量不但会促进酪氨酸酶催化氧化，生成脂褐素，在细胞内大量堆积，形成皮肤斑点，同时也会使皮肤血管老化，营养成分不能及时输送到肌肤[6-7].所以，通过抑制酪氨酸酶和清除过量的自由基不但能有效阻止黑素产生、抑制黑素沉着，同时还能增强皮肤对自由基的防御能力，从而达到美白防衰的效果[8].
笔者对19种中草药进行超声提取.以无水乙醇和水作为提取剂，通过比较各提取液对酪氨酸酶和 3种自由基的抑制率，筛选出具有较强的酪氨酸酶抑制作用和较好抗氧化能力的中草药.
1.1  试剂与仪器
L-酪氨酸、酪氨酸酶(25 kU)，上海生工生物工程股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)，上海梯希爱化成工业发展有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma-Aldrich公司；邻苯三酚、盐酸、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢
钾、维生素C(Vc)，均为分析纯；当归、红景天、赤芍、白蔹、人参、黄芩、桑葚、苦参、玉竹、葛根、六月雪、茯苓、川芎、白芨、苦丁茶、金银花、白芍、苍术，均购于百姓缘大药房；黄蜀葵花，购于阜阳；蒸馏水，实验室自制.
UV-1750紫外-可见分光光度计，日本岛津；JK3200B超声波清洗器，合肥金尼克机械制造有限公司；AB104-N分析天平，精度0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司.
1.2 实验操作
1.2.1 制备中草药提取液
称取19种干燥、粉碎后的中草药各1.0 g，选择无水乙醇和水分别为提取剂超声提取.先分别加入提取剂40 mL，超声30 min后过滤；再向滤渣中加入40 mL该提取剂，继续超声30 min，合并两次滤液，并将其定容到100 mL，制得各中草药提取液原液.原液浓度为10 mg·mL-1，作为抑制酪氨酸酶测试液；原液稀释为1 mg·mL-1作为清除自由基测试液；均以Vc做阳性对照.
1.2.2 酪氨酸酶抑制率的测定
分别配置pH=6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)，1 mg·mL-1的L-酪氨酸溶液，0.07 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液.按以下设置组加样，1测试样：2.0 mL PBS+0.5 mL酪氨酸酶溶液+0.5 mL L-酪氨酸溶液；2测试样：2.5 mL PBS+0.5 mL酪氨酸酶溶液；3测试样：0.5 mL样品溶液+1.5 mL PBS+0.5 mL酪氨酸酶溶液+0.5 mL L-酪氨酸溶液；4测试样：0.5 mL样品溶液+2.0 mL PBS+0.5 mL酪氨酸酶溶液.将各测试样混匀，置37 ℃水浴中保温30 min后立即于475 nm处测吸光度(A)[9].按公式(1)计算酪氨酸酶抑制率(I)
其中：A1～A4为测试样1～4在475 nm处的A值.
1.2.3 抗氧化能力的测定
1.2.3.1 DPPH·抑制率测定
将3 mL中草药待测液和3 mL浓度为0.200 mmol·L-1的 DPPH·乙醇溶液加入同一具塞试管中，摇匀，室温下置于暗处30 min，测定其在波长517 nm处的吸光度Ai1，同法测定提取剂与DPPH·溶液各3 mL混合后的吸光度A01以及该样品溶液与无水乙醇各3 mL混合后的吸光度
Aj1，依据公式(2)计算中草药对DPPH·的抑制率(S1)[10-11]
1.2.3.2 ·OH抑制率测定
在同一具塞试管中分别加入浓度为9.0 mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液和9.0 mmol·L-1的FeSO4溶液，以及中草药待测液各2 mL，然后加入8.8 mmol·L-1 H2O2溶液2 mL，摇匀，置于37 ℃水浴中反应30 min，以蒸馏水为参比，在波长510 nm处测定吸光度Ai2；以蒸馏水2 mL替代水杨酸-乙醇溶液测定吸光度Aj2；用提取剂2 mL替代中草药待测液并测定吸光度A02.依据公式(3)计算中草药对·OH的抑制率(S2)[12]
中草药名称
抑制率测定
将5 mL pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液加入具塞试管中，先置于25 ℃水浴中预热20 min，然后加入2 mL待测液和0.5 mL浓度为5.00 mmol·L-1的邻苯三酚溶液(用10 mmol·L-1的HCl溶液配制)，摇匀后放入25 ℃的水浴中反应4 min，以10 mmol·L-1的HCl溶液作参比，选择波长320 nm测定吸光度Ai3；以0.5 mL的HCl溶液替代邻苯三酚溶液，测定吸光度Aj3；用2 mL提取剂替代中草药待测液并测定吸光度A03.依据公式(4)计算中草药对·O2-的抑制率(S3)[13]
1.2.4 IC50测定
用上述同样方法测定提取物和Vc在不同浓度下对酪氨酸酶的抑制率及其抗氧化能力，并依据浓度-抑制率曲线估算出半数抑制浓度(IC50).以Vc作为酪氨酸酶抑制率测试和抗氧化能力测试的阳性对照组.
1.2.5 数据处理
每组实验重复3次，数据采用Excel统计，以x±s表示.
2.1 19种中草药的选择依据
我国的中医药美容有着两千多年的历史，具有美容功效的药物已达160余种.笔者从中医药美容古方中选取祛斑、增白皮肤使用频率较高[14]，或文献报道[15-16]具有较好抑制酪氨酸酶活性的19种中草药作为研究对象.依据中医药美容祛斑原理，红景天、人参补气养血，当归、川芎、赤芍、白芍、白芨活血化瘀，茯苓、苍术、六月雪健脾利湿，白蔹、葛根、黄芩、黄蜀葵花、苦丁茶、苦参、金银花清热、解毒、散结、凉血、化瘀，玉竹养阴生津，桑葚补肝益肾，所选的19种中草药虽以不同机制作用于人体，都具有一定的靓白皮肤的功效.
2.2 19种中草药对酪氨酸酶的抑制作用
酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，在黑素形成过程中分别参与催化一元酚羟基化生成邻二羟基化合物和氧化邻苯二酚生成邻苯二醌这两类不同的反应，是黑素生成的关键酶，其活性强弱决定了黑素数量的多少[2].目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用[17].因此，对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白效果的主要指标.
在黑素的生成过程中，在酪氨酸酶的催化作用下，首先由酪氨酸转化为多巴，多巴再转化为多巴醌.多巴醌是一种在波长475 nm处有特征吸收的有物质.当加入对酪氨酸酶有抑制作用的样液时，多巴醌的合成量下降，下降的程度与样液的浓度呈一定的量效关系，因此依据475 nm的吸光度变化比较样液对酪氨酸酶的抑制作用的强弱[18-19].
19种中草药提取液对酪氨酸酶的抑制率测定结果见表1.由表1可知：19种中草药的无水乙醇提取液和水提取液对酪氨酸酶都有一定的抑制作用.其中茯苓、赤芍、红景天、白蔹、黄芩、人参、葛根的无水乙醇提取液对酪氨酸酶的抑制率都在80%以上；赤芍、红景天、人参、白蔹、黄芩、茯苓、桑葚的水提取液对酪氨酸酶的抑制率也在80%以上.对前6种中草药进行梯度稀释，分别测定其对酪氨酸酶抑制作用，并计算IC50.IC50 为抑制率达到50%时的样品浓
度，IC50 的值越小，对酪氨酸酶抑制活性越高.
对前6种中草药酪氨酸酶抑制强弱复筛的测定结果见表2.由表2可知：6种中草药无水乙醇提取液中只有茯苓无水乙醇提取液的IC50(0.101 mg·mL-1)小于Vc(0.314 mg·mL-1)，说明茯苓醇提液比Vc具有更好的酪氨酸酶抑制作用.6种中草药水提取液的IC50都比Vc的大，说明该6种中草药水提取液的酪氨酸酶抑制作用均弱于Vc.
2.3 19种中草药提取液对DPPH·的抑制作用
DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫，在波长517 nm处具有最大吸收.当有抗氧化剂存在时，DPPH·的单电子被捕捉而使其颜变浅，在最大吸收波长处的吸光度值会下降[20]，根据吸光度与浓度呈一定的量效关系，可推知体系中的DPPH·含量变化，用于评价样液的抗氧化能力.