- 引言 -
单抗是一个万亿产值“赛道”，目前性抗体仍然是研发热点。为了提升效果，传统单抗疗效还需要得到进一步提升，如亲和力、在CAR-T、ADC中的渗透率等等。但这些劣势是传统抗体分子与生俱来的，要克服这些根深蒂固的缺陷，就要从改造抗体分子入手。抗体改造策略千变万化，总归还是九九归一，着眼于人源化改造、亲和力提升、和针对肿瘤、自然杀伤细胞的抗体掩蔽（masking）等等在免疫中出现的“老大难”问题，本文详细总结了对抗体可变区已展露“曙光”的改造策略，并展望了将这些改造后的抗体片段用于CAR-T、BITEs、多抗等免疫的未来前景。
一、抗体改造：突破难点，提高药效
自18年第一个双抗blinatumomab和19年纳米抗体caplacizumab获批，用于癌症免疫的抗体片段构建工程取得了前所未有的进展。
图1 抗体片段改造工程图解。可变区人源化、多肽掩蔽、CDR区突变、抗体可变区替换和Fc突
变
目前，通过抗体改造得到的各种构型已达数百种，如scFv、nanobody等。这些经改造的抗体片段较普通抗体优势主要在于：
①能够穿越血脑屏障
②降低FC不良反应发生率、成本低廉、稳定性高、免疫原性低。
③在工程化时因其模块性质更易改造。
尽管这些抗体片段更易提高药物疗效和安全性，但临床获批的抗体片段相关方案很少，本文系统介绍和总结了关于抗体片段研究进展，并展望了未来的开发方向。
二、scFv & Nanobodies: 抗体改造领域的“明星分子”
scFv和纳米抗体是小分子抗体药物的代表，无论是应用范围还是成药性都处于“伯仲之间” ，本文将这两种小分子作为抗体工程片段的代表，从结构、应用等多方面进行分析。
Round 1:结构
1 | scFv scFv由VH区和VL区连接组成。由于结构简单，scFv能作为药物结合物、成像示踪剂、稳定剂或其他结合区域引入抗体。但由于缺乏FC区域，scFv功能还是会受到一定限制。如稳定性差，容易聚集或错误折叠，因此scFv还需要进一步优化。 |
2 | Nanobody 纳米抗体是来自骆驼体内的单链抗体，天然缺乏轻链和CH1区，分子大小为12-15Kda左右，大约只有单链抗体的一半。 纳米抗体的CDR3区比普通抗体的长得多，因此能访问较为隐蔽的靶点。同时纳米抗体理化性质优越，能在高温、高压、低pH值等极端条件下保持稳定。 近期研究发现，强稳定性能让纳米抗体在胞内表达，这就为靶向胞内抗原提供新的思路。 此外，纳米抗体CDR3区、FR2区中保守的疏水残基被亲水氨基酸取代，以及含有的额外二硫键，都让纳米抗体能够保持构象稳定，不易聚集。因为纳米抗体不含FC区和尺寸较小，纳米抗体的免疫原性远低于普通抗体。虽然非人源化的纳米抗体的半衰期相对较短，但免疫原性是最低的。但降低纳米体免疫原性的抗体工程，仍然是研究热点。 21天纳米抗体开发计划 抗体开发速度和成本都是关键问题，纳米抗体是这两个问题的理想解决途径。首先，纳米抗体开发成本低、生产周期短，能进一步缩短药物研发进程，在单抗开发中先人一步取得优势。 成都仁域公司在多年研发过程中也在不断总结，不断优化，通过打破常规思路，用青年骆驼代替羊驼作为免疫动物，在第21天时就获得了达到理想的免疫效价的纳米抗体。 图2 羊驼、骆驼免疫效价检测（仁域供图） 仁域同时对骆驼和羊驼进行免疫，在骆驼免疫后的第21天（第二针）就已得到理想效价，远远优于传统的羊驼免疫途径。再配合噬菌体展示高通量筛选系统，能快速筛选出具有高亲和力的抗体分子，助力抗体改造工程。 Round 2 :scFv&VHH 改造工程 |
单链抗体和纳米抗体与单抗相比具有更好的组织穿透性：更高的内皮和上皮组织的穿透率，并且尺寸较小，小分子抗体而在肿瘤间质中扩散得更快。但也会带来半衰期较短的问题，难以在慢性病中应用。因此，已开发了许多策略来改善ScFv和纳米抗体的半衰期。 例如： 1 将人Fc结构域连接到C末端 2 将抗白蛋白抗体的可变区连接到scFv或纳米抗体内 3 与人血清白蛋白(HSA)偶联 但有得必有失，与HSA的偶联虽然使纳米抗体的半衰期延长了5-10倍，但分子量也增加到了50kDa。 虽然较短的血浆半衰期和Fc区的缺乏可能导致小分子抗体的生物利用度和免疫应答低于mAbs，但这些特性使scFv/纳米抗体特异性更高和副作用更少。此外，纳米抗体因其半衰期较短，也是医学成像的理想选择。 改造思路：多价抗体片段（Multivalent ） 以scFv为代表的单价抗体片段，可以通过抗体工程改造成多价抗体片段，如二聚体、三聚体、四聚体、迷你体或其它更复杂的形式（图3 ）。 图3：四类抗体格式结构示意图。I：单特异性抗体，包括完整的Ig G、纳米抗体、scFv和VH-scFv；II：双特异性抗体，包括双特异性VHH、双特异性scFv、Diabody、Dart、微型抗体和scFv-Fab；III：多特异性抗体，包括三价VHs、Triabody、四体、串联Diabody、(scFv)2-Fab；IV：应用于CAR的抗体格式，包括基于纳米体的CAR、基于双特异性纳米体的CAR、scFv CAR和基于双特异性scFv的CAR。 多价抗体形式表现出远超单价抗体的特异性和亲和力。 | |
三、单价形式
（MONOVALENT FORMAT）
由于缺少Fc区，纳米抗体和单链抗体不能激发免疫反应（ ADCC、 ADCP或CDC等）。对单价抗体片段的改造更侧重于增强拮抗作用。自上世纪九十年代起，scFv和nanobody就已用来靶向一些单抗已取得良好作用的靶点。
研究发现，抗体片段的实体瘤穿透作用更强、不良反应发生率更低，成本低廉。
应用①：EGFR家族：
EGFR在多种上皮细胞肿瘤中过表达，如乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)等。它是癌症干预的主要抗原之一。HER2则主要在乳腺癌和卵巢癌中过度表达，其下游信号通路与EGFR相似，因表达水平较高，HER2已成为乳腺癌的理想靶点。
尽管抗EGFR/HER2药物取得了成功，但仍可通过抗体片段工程进行改进。例如通过加入单一特异性抗体片段。美国FDA最近批准Fab arm-exchanged的双特异性抗体amivantamab用
于非小细胞肺癌的，该单抗能同时靶向EGFR和酪氨酸蛋白激酶Met(CMET)。也在开发抗HER2 nanobody/scFv,以提高抗HER2疗法的渗透性。
由于缺乏Fc，抗体片段不能发挥ADCC或ADCP的作用。已开发出将药物与抗体片段偶联来产生抗肿瘤毒性的方法。CaM-H2是一种抗HER2 131-碘(131I)偶联的纳米抗体，用于晚期和进展性HER2阳性恶性肿瘤，目前正在进行I/II期临床试验。由于体积很小，这种纳米抗体能够跨越血脑屏障，靶向传统抗体无法接触的转移性HER2阳性肿瘤。
HER3在83%的胃肠道肿瘤和20%的乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌中的表达高于正常组织，HER3还可能形成异二聚体促进肿瘤增殖，使其成为癌症免疫的关键靶点。
Lumretuzumab能抑制HER3与配体结合或磷酸化。在I期临床试验中，单独使用Lumretuzumab和其他抗HER3单抗的控制率仅为21%，没有发现ADCC效应。随后，纳米抗体被用于研究靶向HER3结构域，介导抗增殖作用。虽然针对HER2和HER3的抗体片段不能发挥ADCC或ADCP的作用，但它们可以作为多特异性抗体复合体的构建块，这些抗体聚合体针对HER3和HER2上的独特表位，以减少单一疗法容易出现的耐药性。
应用②：血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF）
血管内皮生长因子及其受体(VEGFR)在血管生成和血管生成过程中高度表达，能促进结肠癌、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤中新血管形成。抑制VEGF和VEGF受体能在化疗时延长癌症患者的生存期。bevacizumab能中和VEGF，于2004年获FDA批准用于转移性结直肠癌。
目前，针对血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体的纳米抗体很少用于抑制肿瘤血管生成，抗血管内皮生长因子纳米抗体可在体外抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和血管形成。
HGF是一种与cMET受体相互作用的类似纤溶酶原的蛋白。这种参与导致酪氨酸激酶的激活，从而促进肿瘤的生长和转移。
目前，有5种单抗正处于结直肠癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、胃癌和食道癌的III期临床试验阶段。但在III期临床试验时，即使在cMET高表达的患者中，onartuzumab(抗cMET)和rilotumab(抗HGF)也没有显示出显著改善作用。为了解决这个问题，开发了针对整个cMET胞外区的纳米抗体，结果发现肿瘤组织的摄取率更高，并且与生理盐水对照相比，肿瘤生长延迟。
纳米技术在现实生活中的应用传统抗体在癌症中的成功对抗体片段形式的研究是一把双刃剑，抗体片段隐含的安全问题、半衰期问题以及尚未得到证明的效果都很难忽视。然而，抗体片段由于其灵活的模块特性，在多特异性抗体构建和嵌合抗原受体T(CAR-T)/CAR-自然杀伤(NK)细胞中显示出了传统抗体无法比拟的优势。
四、多价形式（MULTI-SPECIFIC FORMAT）
多特异性抗体形式由两个以上的抗体可变片段组成，可以仅由VH结构域构成，也可以由VH和VL结构域组成，它们能与多种抗原结合(图3)。通过顺序性或同时结合多个抗原，多特异性抗体能产生多种功能。
双特异性T细胞结合蛋白(BITE)抗体
由于缺乏FCR，常规单抗无法聚集T细胞。但可以设计通过抗CD3scFv来“”T细胞的双特异性抗体。
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