高比活度碳-14标记吡虫啉的合成与分析
杨征敏;张贵华;许亚军;见才广;李霄;叶庆富
【摘 要】以[14C]碳酸钡为原料,通过格氏、还原、溴化和亲核取代等五步反应制备了碳-14标记吡虫啉的粗品,经制备型HPLC纯化获得了目标物14 C-吡虫啉(1-(6-氯-3-吡啶[14 C]甲基)-N-硝基咪唑-2-亚胺,1354.2 MBq)纯品,反应总放化收率为51％.目标物化学结构经质谱(ESI-MS)和核磁共振氢谱(1 H NMR)确认,其放化纯度和化学纯度分别以放射性薄层层析-同位素成像分析法(TLC-IIA)、离线放射性高效液相谱法(HPLC-LSC)、在线放射性高效液相谱法(HPLC-FSA)和多波长高效液相谱法(HPLC-PDA)测定.结果表明,目标物14 C-吡虫啉的放化纯度和化学纯度均大于98％,比活度为1871.46 GBq/mol.目标物14 C-吡虫啉可作为放射性示踪剂,用于吡虫啉在不同植物中的定向积累与代谢特征研究.%A version of carbon-14 labelled imidacloprid,(E)-N-(1-((6-chloropyridin-3-yl) [14 C]methyl)imidazolidin-2-ylidene)nitramide (1354.2 MBq),was synthesized from barium [14 C]carbonate via Grignard reaction, reduction, bromination, nucleophilic substitution reaction and purified by preparative HPLC with the overall yield of 51％.The labelled prod-uct was identified by using ESI-MS and 1 H NMR.Its r
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adiochemical and chemical purity are more than 98％,determined by TLC-IIA,HPLC-LSC,HPLC-FSA,and HPLC-PDA, respectively.The specific activity of the product is 1871.46 GBq/mol.This product can beused as radiotracer in the study of the directional accumulation and metabolism of imidaclo-prid in plants.
【期刊名称】《核化学与放射化学》
【年(卷),期】2018(040)003
【总页数】7页(P196-202)
【关键词】同位素标记合成;吡虫啉;碳-14;杀虫剂;放射性示踪剂
【作 者】杨征敏;张贵华;许亚军;见才广;李霄;叶庆富
【作者单位】上海启甄环境科技有限公司 同位素标记合成研究中心,上海 201403;上海启甄环境科技有限公司 同位素标记合成研究中心,上海 201403;上海启甄环境科技有限公司 同位素标记合成研究中心,上海 201403;上海启甄环境科技有限公司 同位素标记合成研究中心,上
海 201403;上海启甄环境科技有限公司 同位素标记合成研究中心,上海 201403;浙江大学 原子核农业科学研究所,浙江 杭州 310029
【正文语种】中 文
【中图分类】TL923;O628.4;S482.3
吡虫啉(imidacloprid)是第一个商品化的高效烟碱类内吸性杀虫剂，作用于害虫的烟酸乙酰胆碱酯酶受体，具有高效、广谱、低毒、安全和高选择性的特点，对人、畜、植物和天敌等安全。因而该药自1991年由德国拜耳公司投入市场，迅速成为全球杀虫剂市场的主流品种。但随着世界范围内吡虫啉的频繁使用，该杀虫剂造成的生态环境问题日益凸显。2007年，Cox-Foster等[1]报导吡虫啉会引发“蜂崩溃综合症”。2012年，国外学者[2-3]相继发现吡虫啉会减弱蜜蜂觅食能力和降低蜂增长速率及蜂王的繁殖能力。国外研究还表明，吡虫啉在水域环境中广泛分布[4-5]，且对水生及陆生无脊椎动物(如底栖动物、蜉蝣稚虫、甲壳虫和苍蝇等)具有致死作用[5-7]。Hallmann等[8]通过连续7年研究发现吡虫啉可能通过营养级联效应进而引发自然生态系统灾害，如在吡虫啉严重污染的水环境区域，无脊椎昆虫大量死亡，并在营养级联效应的作用下，食虫鸟类种和数量也急剧下降。当水体吡虫啉质量浓度达到20 n
g/L时，鸟类数量每年趋于下降3.5%。上述研究揭示，尽管新烟碱类杀虫剂吡虫啉通过120多个国家数百种作物登记相关试验要求[6]并已应用于农业生产25年，但人们对吡虫啉在植物中的定向积累(尤其是与蜜蜂等非靶标生物营养级联有关的植物器官的残留情况)与代谢特征等的认识仍不够客观全面。
放射性同位素示踪技术具有痕量精准、溯源追踪等独特优势，因此，在国际上农药等有机污染物在复杂环境介质中的吸收分配、代谢降解、迁移转化、生物效应等方面的研究多采用放射性同位素示踪技术[9-13]。为了研究吡虫啉在不同植物中的定向积累与代谢特征，需要借助于放射性同位素示踪技术，而放射性同位素碳-14标记的吡虫啉是示踪研究所必需的示踪剂。吡虫啉属于超高效杀虫剂，田间用量小，故需要高比活度(a≥1 850 GBq/mol，1 mCi=3.70×107 Bq)的吡虫啉才能满足下游示踪研究的要求。国际上对吡虫啉的碳-14标记合成工作主要由德国拜耳公司完成，主要标记位点为吡虫啉分子中亚甲基、亚乙基和咪唑啉环2位碳原子，但其标记合成工艺均尚未公开报道[14-15]。综合考虑下游示踪试验要求和碳-14原料市场供应等因素，本研究拟以亚甲基作为标记位点，该标记方式最具可行性，拟研究高比活度[亚甲基-14C]吡虫啉的合成与质量指标分析。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
放射性[14C]碳酸钡，比活度2 146 GBq/mol，放化纯度99.9%，美国ARC公司；2,5-二苯基噁唑(PPO)，高效液相谱(HPLC)纯度大于99.0%，日本TCI公司；1,4-双(5-苯基-2-噁唑)苯(POPOP)，HPLC纯度大于98.0%，日本TCI公司；Optiphase HiSafe 3闪烁液，美国PE公司；HPLC和高效液相谱-质谱联用分析(HPLC-MS)用甲醇分别为谱级和质谱级，美国Fisher Scientific公司；其它试剂均为市售分析纯。溶剂按照文献[16]方法纯化。
Varian 400 MHz核磁共振仪(以TMS为内标)，美国瓦里安公司；Agilent 7890B-5977B气相谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Waters Alliance e2695-2489/Acquity QDa高效液相谱-紫外光谱/质谱联用系统，Waters 2545-2998 PDA制备液相谱仪，Waters Alliance e2695-ν.ARC FSA/2998 PDA/Acquity QDa MS高效液相谱-流动液体闪烁测量/二极管阵列检测器/质谱联用系统(FSA与PDA并联，MS串联于PDA后)，其中谱、质谱设备来自美国Waters公司，FSA来自美国Aim Research公司；Tri-Carb 4910TR液体闪烁测量仪，美国PE公司；Typhoon FLA9500 IP多功能激光成像仪，美国GE公司；Milli-Q Reference S. Kit (18.2 MΩ/cm,25 ℃)超纯水制备系统，默克化工技术(上海)有限公司；BT25S (精度0.01 mg)
和BSA22 4S-CW(精度1 mg)电子天平，德国赛多利斯公司。以上与定量分析相关仪器均通过3Q认证和上海市计量测试技术研究院校准。
1.2 同位素标记化合物的合成
放射性同位素碳-14标记吡虫啉(1)的合成路线示于图1。
*表示碳-14标记位点图1 放射性同位素碳-14标记吡虫啉的合成路线Fig.1 Synthetic route of radioisotope carbon-14 labelled imidacloprid
1.2.1 Konchel型格氏试剂(3) 在氩气保护下，向干燥三口反应瓶中加入无水氯化锂(424 mg,10.00 mmol)；热风(设置250 ℃)加热，重复抽真空-充氩气操作5次以彻底干燥氯化锂。加入表面光亮的镁条(491 mg,20.20 mmol)，再用氩气置换反应瓶内气体5次；加入无水四氢呋喃(THF，10 mL)，搅拌至氯化锂完全溶解；再加入二异丁基氢化铝(1 mol/L,160 μL,0.15 mmol)，室温搅拌5 min。降温至0 ℃，缓慢滴加2-氯-5-溴吡啶(1.540 g,8.00 mmol)无水THF溶液(10 mL)，继续搅拌至2彻底消耗(1.5 h)，反应溶液由无变为茶悬浊液。静置后析出白固体，上部为茶黄透明溶液，此溶液即Konchel型格氏试剂(3,浓度约为0.4 m
ol/L)[17]。放射性薄层层析(TLC):EtOAc/石油醚(PE)体积比为1/20,Rf(2)=0.72。以4-苯基苯甲醛无水四氢呋喃溶液检验其反应性能，结果表明制备的中间产物格氏试剂(3)反应性能满足实验要求。
1.2.2 6-氯-吡啶-3-[14C]甲酸(4) 在氩气保护下，将自行设计制作的微型放射性二氧化碳反应系统中各部件(包括二氧化碳发生器、二氧化碳反应器、微型气体循环泵、气体压力缓冲器、微型干燥器、玻璃旋塞和连接管件等)趁热连接组装。各部件组装完毕，用热风(设置250 ℃)加热系统，重复抽真空-充氩气操作5次以彻底干燥系统，最后关闭系统所有旋塞。在氩气保护下，打开二氧化碳反应器的瓶塞，迅速加入[14C]碳酸钡(307 mg, 2 851.22 MBq，比活度已调至1 868.5 GBq/mol)，塞上瓶塞，重复抽真空-充氩气操作5次以彻底排除系统中空气。将各乳胶塞密封牢固，油泵抽真空至系统压力(0.07 Pa)稳定，关闭与油泵相连的旋塞，保持系统处于高真空状态，打开二氧化碳反应器和二氧化碳发生器之间的旋塞。将格氏试剂(3,4.60 mL,1.84 mmol)转入二氧化碳反应器，补加无水四氢呋喃(3 mL)，用冰-盐浴分别将二氧化碳发生器和二氧化碳反应器冷至0～5 ℃，然后向二氧化碳发生器中缓慢滴入已充分脱除二氧化碳的浓硫酸(7 mL)，产生的[14C]二氧化碳经微型干燥器进入二氧化碳反应器与格氏试剂(3)反应。待二氧化碳反应器液面无明显气泡溢出时，打开二氧化碳反应器和二氧化碳发生
器之间气体回路上的旋塞，向系统补充适量氩气，启动微型气体循环泵，利用氩气运送系统残余[14C]二氧化碳与格氏试剂反应。氩气循环1 h后反应结束。TLC:乙酸乙酯(EA)/PE体积比为1/1，Rf(4)=0.42。以NaOH溶液(0.5 mol/L)淬灭反应，调溶液pH至13，减压蒸除反应液中THF，余液加水至100 mL，用乙基叔丁基醚萃取(50 mL×2)除杂。水相pH用盐酸(1 mol/L)调至6，乙基叔丁基醚萃取(80 mL×6)，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得淡黄固体(4，235 mg，反应收率 97%)。
1.2.3 6-氯-吡啶-3-[14C]甲醇(5) 在氩气保护下，将6-氯-吡啶-3-[14C]甲酸(4,233 mg,1.46 mmol)加入干燥Shlenk反应管；热风加热，用氩气置换反应管内气体5次，冷至室温；用注射器加入无水THF(5 mL)，用冰-盐浴冷却至0～5 ℃，缓慢逐滴加入-四氢呋喃溶液(1 mol/L,3.7 mL,3.70 mmol)。滴毕，继续搅拌1.5 h；自然升至室温，搅拌1.5 h后反应结束。TLC:EA/PE体积比1/3,Rf(5)=0.45。向反应体系中缓慢滴加水直至无气泡生成以淬灭反应。减压浓缩除去THF，所得混合液用二氯甲烷萃取(70 mL×6)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩得浅黄液体(5,192 mg,反应收率92%)。
1.2.4 2-氯-5-(溴[14C]甲基)吡啶(6) 在氩气保护下，将6-氯-3-吡啶[14C]甲醇(5,189 mg,1.30
mmol)加入干燥Shlenk反应管，热风加热，用氩气置换反应管内气体5次；用注射器加入无水二氯甲烷(8 mL)搅拌溶解，用冰-盐浴冷至0～5 ℃，逐滴加入PBr3(246 mg,910 μmol)。滴加完毕，保持此温度搅拌1 h；自然升至室温，搅拌1 h后反应结束。TLC:PE/EA体积比5/1；Rf(6)=0.50。向反应体系缓慢滴加w=5% Na2CO3溶液直至无CO2气泡生成以淬灭反应，用二氯甲烷萃取(80 mL×5)。合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩得浅黄液体(6,231 mg,反应收率86%)。
1.2.5 1-(6-氯-3-吡啶[14C]甲基)-N-硝基咪唑-2-亚胺(1，14C-吡虫啉) 在氩气保护下，将2-氯-5-(溴[14C]甲基)吡啶(6,227 mg,1.09 mmol)、N-硝基亚氨基咪唑烷(7,149 mg, 1.14 mmol)和无水Cs2CO3(391 mg,1.20 mmol)加入干燥Schlenk反应管；用氩气置换5次，注入干燥乙腈(8 mL)，内温升至80 ℃，剧烈搅拌50 min后反应结束。将反应液冷却至室温，用硅藻土层滤除残余Cs2CO3，滤液减压浓缩得淡黄固体粗产品。TLC:DCM/丙酮体积比10/1; Rf(1)=0.45。将粗产品溶于甲醇，利用制备型高效液相谱纯化，收集保留时间11.08 ～14.68 min洗脱组分，减压浓缩得白固体(1,186 mg,1 354.2 MBq,反应收率67%)。谱条件：xBridge Prep C18柱 (10 μm,150 mm×φ19 mm; Waters Co., MA,USA)，梯度洗脱(min/%A)控制:0/15,5/15,10/30,25/30,30/15,35/15；A为乙腈,B为水。流速12 mL/min,进样量
600 μL,波长270 nm。