摘要：综述胚胎干细胞培养基、有饲养层培养体系和无饲养层培养体系的主要成分，以及无血清胚胎干细胞培养基。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。
关键词：胚胎干细胞 培养体系 培养基
1、培养基的主要组成
ES细胞培养液的组成是在基础培养基上添加血清、IIF、巯基乙醇，L一谷氨酰胺等成分，并使用饲养层细胞或条件培养基(CM)。常用的基础培养基为含高糖(4500mg／L)和谷氨酰胺的
DMEM。由于ES细胞来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，维持其生长代谢所需的营养要充足。高糖的DMEM可以提高ES细胞的增殖速度，同时又能提供饲养层细胞生长所需的能量。ES细胞对谷氨酰胺要求较高，它是细胞合成蛋白质与核酸所必需的，由于谷氨酰胺在溶液中易分解，所以使用前须重新加入。』3一巯基乙醇除了对胚胎细胞的分裂增殖有促进作用外，还可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ES细胞的损害。添加的血清为胎牛血清(FCS)和小牛血清。血清含有丰富的营养成分，在促进ES细胞增殖方面起到很好的作用，并对ES细胞的贴壁生长、集落形态有重大影响。此外它可能含有一些未知的促ES细胞分化的因子，也可能含有微量的血红蛋白和内毒素，会干扰ES细胞的生长。但高浓度的血清并不利于ES细胞生长。不同批次的血清对促进ES细胞生长具有不同的效果。每个ES细胞系依赖于建系时所用的血清批次，若更换血清，则应以该细胞系为供试细胞，在含有待测血清的培养基上进行传代培(8～10代达芙妮老板娘)和克隆测试，测试合格的血清只适用于该细胞系，若用于其它ES细胞系,则仍可能出现不同的效果。故建系和维持ES细胞生长所用血清应为同一批次一。
需添加其它的细胞生长促进因子有干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等。SCF和bFGF对ES细胞生长起促进作用，但也有人认为bFGF醉酒驾驶怎么处罚和SCF对ES细胞生长无
协同作用，在有膜结合形式的SCF存在的情况下，不需加入bFGF一。用表达SCF的ST细胞系培养ES细胞，其生长可不依赖外源SCF。与其它类型的细胞培养不同的是，干细胞的培养必须使用细胞分化抑制因子(DIA)。其中起主导作
用，也是目前研究最多、使用最广泛的是LIF。ES细胞培养液也含有DIA，可配制成条件培养基；饲养层细胞也可起到抑制细胞分化，促进增殖的作用。
2、培养体系
依据DIA的来源不同，培养体系分为有饲养层及无饲养层两大干细胞培养体系。
2．1有饲养层培养体系
饲养层细胞是通过细胞接触机制和非接触机制促进ES细胞增殖并阻止其分化。它能分泌多种细胞因子，提供ES细胞生长的环境和信号。饲养层对ES细胞的分化抑制是其分泌多种因子共同作用的结果。不同ES细胞的最佳饲养层不尽相同，不同的饲养层细胞在使用上也各具优缺点。可做为饲养层细胞有原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)、小鼠成纤维细胞无限系(ST())一-、转入了SCF基因的STO细胞13]、3T3细胞和OP9细胞、原代鸡胚成纤维细胞
、卵巢、输卯管、子宫内膜细胞和胎肝成纤维细胞等细胞，以及膀胱癌细胞、子宫颈鳞状上皮细胞癌细胞等肿瘤细胞。
2．1．1原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)
PMEF作为饲养层培养ES细胞是一种最早和常用的方法一.它能有效地促进ES细胞的增殖并维持其未分化性和多潜能性，可用于大多数动物ES细胞的分离，如用PMEF作饲养层，能成功地分离到牛类ES细胞卫。PMEF对ES细胞分化的抑制作用
可能来源于它们产生的.大多数实验室均采用PMEF作为饲养层分离培养ES细胞，PMEF多来源于14．5d孕鼠，如以10d、18d的PMEF制作的饲养层，ES细胞亦能生长良好，并保持未分化状态l!。在使用前，可用放射线～或丝裂霉素一C处理2h或90rain一一使PMEF失去分裂活性。用1～3代的PMEF培养ES细胞时，可以理想
地维持其未分化状态，并在一定代次内维持其二倍体核型一一。随着传代次数增多，PMEF产生抑制分化因子和促增殖因子的能力会减弱甚至丧失一!。反复制
备PMEF会增大培养的工作量。目前这一缺陷可通过大批地培养并分装冻存，使用时再融
化制备滋养层细胞的方法而得到弥补一一。由于PMEF不具耐药性，故不能作为转染有外源性基因的ES细胞筛选用。
2．1赵丽颖男人装．2小鼠成纤维细胞无限系(ST())细胞
用STO饲养层培养ES细胞时，可以较好地维持ES细胞的未分化状态，但是一般认为，sTO细胞系经长期培养和反复冻存后会使分泌细胞因子的能力下降.使ES细胞的集落形态不够典型，且不能有效维持其二倍体核型。但对不同的ES细胞，STO的影响不同。小鼠全胚或ICM在STO饲养层和PMEF饲养层均附着增殖，并可获得ES细胞。以STo、PMEF和STO+BRI(大鼠肝细胞)为材料克隆猪ES一辈子暖暖的好细胞，各实验组都能使ES细胞附着和增殖，但STO和ST()4-BRL组最高传代数为10代，而PMEF组传代数仅为3代。将小鼠囊胚在不同类型饲养层培养，在4d之内，内细胞团分化速度依次为STO>PMEF>REFE。Thomson等于1998年底分别报道了利用小鼠的STO细胞作为饲养层，分离培养人受精卵发育的胚泡内层细胞和怀孕5～9周的流产胎儿的性腺脊细胞，建立了人的ES和EG(胚胎原始性生殖细胞)细胞系，此细胞具有正常的核型，表达高水平的端粒酶活性和灵长类ES细胞的特异性细胞表面分子，可分化发育为含外、中、内三个胚层的细胞。
2．1．3其它细胞
SNL是一种转染了neo"／抗性基因和LIF基因的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌本苷亚系STO细胞亚株，它可以长期在体外进行传代和冻存，并能分泌抑制ES细胞分化的LIF，故作为饲养层细胞一”，体外培养条件基本同PMEF饲养层，但需加L一谷氨酰胺。使用SNL可免去准备怀孕母鼠的繁琐工作。又因其带有neoT抗性基因，故可以用于转基因ES细胞的筛选。以胎牛肝成纤维细胞(BFLF)作为饲养层的培养可分离到绵羊和山羊类ES细胞。ES细胞在膀胱癌细胞、子宫颈鳞状上皮细胞癌细胞等肿瘤细胞饲养层上生长更旺盛。原代鸡胚成纤维细胞饲养层使小鼠ES细胞克隆传10代以上卫。
2．2无饲养层培养体系
采用无饲养层的方法进行培养，首先，可克服使用饲养层细胞培养ES细胞的繁琐；其次，可排除实验中的细胞接触抑制作用及饲养细胞分泌其它因子的干扰，从而更为准确地研究某一因子对ES细胞生长的影响；第三，能排除处理饲养层细胞时所用丝裂霉素对ES细胞的毒性作用。但用条件培养基作培养液分离和克隆ES细胞，只能在短期传代中维持ES细胞全能性及核型正常。常用的方法是在培养液中加入外源的I1F和使用能分泌IIF的细胞制
备条件培养液等。用转基因的方法，将IIF的基因转入ES细胞中，建立不依赖外源LIF的ES细胞系，也是方法之一。
2．2．1LIF
LIF是一种白血病抑制因子，也是理想的ES细胞分化抑制剂[32,33]。外源LIF可使ES细胞在未分化状态下长期培养，在ES细胞培养液中加入LIF即可用于无饲养层的ES细胞培养。对小鼠而言，在一定浓度范围内，IIF与ES细胞克隆效率之间存在量效关系。当LIF浓度达到1000～5000IU／ml时，从ICM中分离ES细胞的效率可达959／5以上一。也有实验认为LIF的最适用量为1000IU／ml~。
2．2．2细胞培养液
Smith和Hooperl3研制了一种条件培养基用于分离和克隆ES细胞。其方法是将基础培养液(Glusgow—Eagle改良培养液+0．1M非必需氨基酸+1mM丙酮酸钠+109／6NBS+0．2mM二巯基乙醇)与STO饲养层细胞共同培养24h(37C、5CO、饱和湿度)后获取培养液，用0．2／xm滤膜过滤，用该培养液培养胚胎瘤细胞。其能促进细胞增殖，抑制由维甲酸(RA)和
二甲基亚砜(DMSO)诱导的细胞分化。用大鼠肝细胞(BRL)培养液配制大鼠肝细胞条件培养基(BRL—CM)，在无饲养层条件下分离和克隆了小鼠ES细胞。用BRI细胞培养上清液制备的条件培养基用于ES细胞的培养与加LIF的ES细胞培养基具有同样的培养效果，而且远比LIF经济。2～3周龄大鼠的心肌细胞培养上清也可以用于ES细胞培养_3。用于制备条件培养基的其它细胞还有：HBC(人膀胱癌细胞株5637)，PSA一1(一种小鼠EC细胞)，PC10—6R(LIF转染的COS细胞)，T一3细胞(一种小鼠EC细胞)[31j。在CRlaa(CharlesRosenkra1氨基酸)+亚硒酸钠+胰岛素+转铁蛋白+59／5FCS培养系统中低密度悬浮培养体外受精牛胚胎，并用免疫外科手术法分离ICM，该ICM在该培养基中培养101d，保持未分
化状态。用这种方法建立了15个培养的ICM细胞系。将培养的ICM细胞进行核移植获得34枚囊胚移入27个受体内，13头妊娠，最终产下4头犊牛[372。对细胞培养液能抑制ES细胞分化的机理的研究发现，细胞培养液中含有分化抑制因子(DIA)。
Smith认为，DIA和LIF是同一种物质，在无饲养层细胞条件下，向培养基中加入LIF(10ng／m1)，可维持ES细胞和畸胎瘤(EC)细胞的多潜能性。从小鼠STO饲养层细胞培养液中提取的DIA，能部分抑制ES细胞分化，该多肽因子分子量为5700l3。大鼠BRL细胞在培养的
过程中，能分泌一种抑制畸胎瘤(EC)和ES细胞分化的因子(其结构与母亲节什么时候几月几号LIF相似)。Yang等。用小鸡肝细胞条件培养基，证明禽类细胞也能产生一种DIA样因子，抑制小鼠ES细胞的分化。由细胞培养液配制的条件培养基含有500～5000IU／mlLIFE。¨。
2．2．3建立不依赖于LIF的ES细胞系
利用无LIF的培养系统建立了ES细胞系，即使在培养液中加入外源性LIF抗体也不影响ES细胞生长，并可长期保持未分化状态和多向分化潜能。杜宪兴等将LIF基因转入ES细胞可使ES细胞不依赖外原性LIF而长期不分化增殖，且不影响ES细胞的多向分化潜能性。
央视美女记者走红2．3无血清ES细胞培养基
GIBCO公司新近推出一种替代FCS的无血清ES细胞培养基，更有利于ES细胞的诱导分化研究。但有实验观察证实，在无血清ES细胞培养基中生长的ES细胞贴附力不如在有血清ES细胞培养基中生长的细胞强。除了使用明胶增强细胞的贴附力外，可以尝试使用多聚氨酸、纤维结合蛋白等增强细胞贴附力的物质等。
3、总结
综上所述，各种ES细胞培养体系的研究与开发，使ES细胞的培养更有效、方便和经济，从而进一步推动干细胞的研究与应用。胚胎干细胞(ES细胞)是来源于植入前胚泡的内细胞团的细胞(ICM)l1和原始殖细胞(PGCs)，它既可分裂增殖为与之相同的保持全能性的细胞，又能分化为分化潜能更小的细胞。如培养于含有白血病抑制因子(LIF)的培养基中，可保持增殖而不分化]。ES细胞的培养条件关键是既要维持细胞的未分化状态和潜能性，又要使其无限增殖。细胞培养能否达到目的，选择合适的培养体系是关键，一般是根据文献及个人的经验提出设计，再通过一系列的实验进行确认。胚胎干细胞的培养成功与否，可以通过细胞集落的形态、二倍体核型检查、能否形成嵌合体动物等方法进行检验。国内外学者已相继建立了大鼠、小鼠、猪、牛，还有鸡、兔、金黄地鼠、灵长类等多种动物的ES细胞系。但国内的ES细胞的建系和培养过程中仍存在着建系率低、培养的细胞中正常核型的比率低及能形成嵌合体的细胞系比率低等问题。由于不同种类动物的ES细胞以及同种不同品系动物的ES细胞的体外培养条件具有明显差异性，如有的ES细胞系极易分化，二倍体核型也很难维持；有的则很不容易分化，二倍体核型容易维持；大多数ES细胞系则介于二者之间。不同的ES细胞系具有不完全相同的特征和营养要求，故每个ES细胞系都应建立适合其生长的最佳条件，维持一个ES细胞系的条件不能用于另一个细胞系。所以，有必要对干细胞的培养体系做一综述。
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