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米酒是一种以糯米为主要原料，配合酒曲和水酿造而成的酒饮料。其酒精度为3%vol~14%vol，含有丰富的葡萄糖、氨基酸、维生素、有机酸、多糖等，泽清透，香气淡雅，可谓老少皆宜的滋补型饮品[1]。早在远古时代，古人
国内外甜酒曲研究进展
刘婧竟，乔发东*
（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）
摘要：甜酒曲菌相组成是决定米酒质量的核心因素。近些年来，各国研究者对其菌种进行了大量研究。文中介绍了中国、日本、韩国、越南、印度等国对甜酒曲微生物的分离，鉴定、组成和育种以及部分菌种特性方面的研究进展，旨在通过对比，相互借鉴，展望我国米酒工业化生产前景和开拓国际品牌市场的可能。
关键词：甜酒曲；微生物；研究进展
中图分类号：TS261.1文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）09-0021-04
Research progress on rice wine starters in the world
LIU Jingjing,QIAO Fadong*
(College of Bioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China)
Abstract:The microflora of rice wine starters plays a key role in the determination of rice wine quality.In
recent years,the microorganisms in rice wine starters have been extensively studied by researchers around the world.The research progresses in China,Japan,Korea,Vietnam and India were discussed with regard to isolation,identification,composition,screening and characteristics of the microorganisms in rice wine starters.By comparison and taking references from each other,the great future of Chinese rice wine industry and the possibility of developing international top brands in China were prospected.
Key words:rice wine starter;microorganism;research progress
收稿日期：2010-05-31
作者简介：刘婧竟（1985-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学；乔发东*，副教授，通讯作者。
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就开始以谷芽为原料，用“糵（酒曲）”来酿造醴。汉代《释名·释饮食》中称“醴，礼也，酿之一宿而成醴。有酒味而已也。”即为现在的甜酒，俗称米酒。在中国，米酒因地域不同而叫法不一（甜米酒、江米酒、醪糟、酒酿与酒糟等）。在亚洲其他国家，米酒的名称更是多不胜数，而大体都是以粮食为主要原料酿造而成，根据酒精度的不同有所区别。米酒是此类粮食酿造酒中最为基础的品种，原料单一，发酵过程简单，因此成为百姓家中自制酒的首选。与此同时也导致了米酒工业化生产和形成品牌商品的困难，
甜酒曲的种类因地域、各家经验而复杂混乱，这是导致米酒质量参差，口味各异的根本原因。另外生产没有统一的运作标准，产品没有健全的品质检验标准等也是导致国内米酒发展缓慢的原因。对我国、日本、韩国、印度、越南等甜酒曲微生物研究进行了综述，通过对比能够相互借鉴，各取所长。
1国内甜酒曲研究
1.1甜酒曲中菌组合研究
米酒是混合菌发酵，其质量和风味的好坏取决于甜酒曲中微生物的落组成及各菌种之间的代谢关系，代谢产物与产品的比例关系等。发酵成熟的米酒中微生物总数为2.0×108个/mL米酒左右，活菌计数结果显示，酵母菌最多，3.0×107个/mL米酒左右，其次是霉菌，为2×103个~ 3×103个/mL米酒，细菌的活菌数差别较大，为0个/mL~ 102个/mL米酒[2]。近两年，通过对米酒中微生物菌相的研究得出米酒发酵过程中各菌种的生长情况[3]。发酵初期霉菌繁殖旺盛，糯米表面长满菌丝，出现肉眼可见的黑孢子，随着发酵时间的增加，霉菌分解淀粉产生大量糖，为酵母菌的繁殖作好了准备，随后糯米中渗出液体，乙醇不断积累，破坏了霉菌的生长环境，导致霉菌数量减少，酵母菌数量占优势。向文良等[4]利用16S~23S rRNA ITS AFLP指纹图谱技术监控四川传统米酒发酵过程中原核微生物的演替，并结合米酒发酵过程中理化因子的动态变化对米酒中原核微生物演替过程进行了分析。实验表明，米酒发酵过程中，随着酒曲的接入，米酒醅中原核微生物伴随米酒理化因子的动态变化而发生落演替。
1.2甜酒曲中霉菌的研究
在米酒的发酵过程中，根霉起着重要的糖化作用。通过对孝感民间传统米酒菌株的分离、鉴定与筛选、培养，表明只有当其中的根霉菌占绝对优势时，才有可能将其他菌的繁殖控制在一定的范围内[5]。王艳萍等[3]从米酒菌分离纯化得到4株菌、1株霉菌、1株酵母菌和2株细菌，进一步确定霉菌是米酒发酵过程中起主要作用的菌，并通过菌落和菌体形态观察初步鉴定该霉菌属于毛霉科毛霉属。宁洁等[6]从发酵米酒中分离筛选出2株能降解淀粉的霉菌，并测定其在初始淀粉含量为15%、28℃条件下
发酵48h，淀粉转化为糖的转化率最大[6]。王卫等[7]以霉菌的18S rRNA为进化指征，PCR扩增得到18S r RNA的部分基因序列，经测序和序列比对，样品霉菌与米根霉（Rhizopus oryzae）有很高的同源性，达到99%。经鉴定甜酒曲的霉菌主要是米根霉，命名为Rhizopus oryzae strain SCLG0818。这些都为今后米酒中霉菌的进一步筛选鉴定奠定了基础。
对米酒霉菌的研究中，最为显著的成果是对米酒中根霉代谢产物凝乳酶的研究。中国清代宫廷便有扣碗酪流传，其原理就是利用米酒中活性较高的凝乳酶使奶液凝固[8]。姜铁民等[9]对米酒凝乳酶进行纯化，通过对其基本特性的研究及与胃蛋白酶、米黑毛霉凝乳霉、牛凝乳霉凝乳过程中的组织状态变化比较，初步认为米酒凝乳酶的动力学或凝乳机制可能与牛凝乳酶等其他天冬氨酸蛋白酶不完全相同。通过对米酒凝乳霉生化特性进一步研究表明，此种酶可以替代牛凝乳霉在奶酪生产中应用[10]。程巧玲等[11]通过
分析江米酒发酵过程中微生物菌数的变化与江米酒的凝乳活力之间的关系初步确定霉菌为产凝乳酶的优势菌，并用酪蛋白平板法进行了验证。薛璐等[12]发现凝乳酶的酶切主要位点在α-酪蛋白第95位M的N-端，同时还存在其他酶切位点[12]。在研究米酒凝乳酶的同时还对米酒中的脂肪酶进行了探索研究[13]。王艳萍等[14]研究得出，糯米酒凝乳酶在36℃时活性最高，pH值适应范围为1~7，镁、钙、钡、锰、铝、铁离子对凝乳酶的凝乳效果有明显影响，使中国在米酒凝乳酶研究中占据领先地位。1.3甜酒曲中酵母菌的研究
米酒发酵过程中，在糖化作用过后，酵母菌大量繁殖，将糖转化成乙醇。国内对米酒中酵母菌的研究主要在菌种的优化和筛选，根据对最终米酒的口感和酒精度的要求选取不同优势的酵母菌种混入甜酒曲。单艺等[15]从云南传统糯米酒中分离得到16株酵母菌，通过产气性能、TTC平板显、产酯实验的初筛方法，筛选出4株酵母菌进行复筛，再通过耐温、耐酒精、耐酸、发酵力实验，最终筛选出理想的米酒酵母菌种，且酵母菌Y2产酯能力较强，用在米酒生产中可增加酯香味。宁洁等[6]对米酒中酵母进行筛选培养，得到1株酵母的积累酒精产量最高为13.5%vol，并在发酵应用实验中，采用二次投入法得到的发酵米酒酒味醇香，酸甜适中。刘念等[16]以优质大曲、小曲及酒糟为原料，筛选出耐高温根霉菌、耐高温耐酒精酵母和产酯酵母。并利用筛选出的菌株制得耐高温米酒曲药，其发酵酒精度为13.5%vol，产酯0.347g/L，产酸0.183g/L。中国的米酒酵母研究已逐步向日本清酒酵母研究水平靠拢，为实现米酒产品面向不同市场需求开辟了科技道路。
1.4甜酒曲中乳酸菌的研究
国内对米酒的菌种研究多为霉菌和酵母菌，对乳酸
菌的研究很少。而乳酸菌在米酒的发酵过程中起着很重要的作用。米酒中的细菌以乳酸菌为主，其产生的乳酸是米酒酸味的主要来源。另外乳酸与乙醇发生反应生成酯类是米酒重要的风味物质，同时乳酸菌代谢过程中产生乙醛和双乙酰，赋予米酒特殊的风味[15]。日本对清酒中乳酸菌的生理生化特性和应用都进行了较为详细的研究。我国近年方开始逐步重视对米酒中乳酸菌的研究，蔡浚泽等[18]从云南及黑龙江的传统米酒中分离出41株乳酸菌，通过产酸能力、产乙醛和双乙酰能力及产酒精能力实验，筛选出产酸能力强的菌株和产乙醛和双乙酰能力强的菌株发酵米酒。有些研究者利用米酒中的乳酸菌直接将米酒作为发酵剂，开发出不同口味的米酒乳饮料[19]，不仅将米酒中乳酸菌应用到实际生产中，而且丰富了饮料市场。
2国外甜酒曲的研究
2.1日本甜酒曲的研究
日本著名的清酒（Sake）享誉世界。基本原料是大米、酒曲和水，酿造过程与中国的米酒稍有不同。根据清酒制法不同分为5类：（1）普通酿造酒：常见的，添加了酒精调整口味的酒；（2）本酿造酒：属
于中档的清酒，口感较好，很受欢迎；（3）纯米酿造酒：不添加酒精，只用米、米曲和水酿制而成，有米香味，口味浓厚；（4）增酿造酒：在勾兑时添加了食用酒精、糖类、酸类等原料配制而成，口味醇甜；（5）吟酿造酒：特殊口味的清酒，酿造工艺高，具有独特的水果香味，被誉为“清酒之王”。其中纯米酿造的清酒与中国的米酒极为相似。
日本一直十分重视清酒的研究，尤其是对酒曲中菌的筛选和培养。早年，日本研究者发现酵母培养初期，假单胞菌把水中的硝酸盐还原成亚硝酸，同时乳酸菌开始增值产生乳酸，亚硝酸和乳酸同时存在的环境使耐性弱的野生酵母被抑杀，随着乳酸菌的不断增加，无论硝酸还原菌还是乳酸菌都开始被抑制，高酸性和高糖度条件使培养液中的杂菌均被抑杀，只有耐性强的清酒酵母可以开始增值，这样扩增得清酒酵母纯度几乎为100%，这种只通过酒曲、水和蒸米带来的乳酸菌控制纯酵母扩大培养的方法，即为著名的自然纯培养增值酵母法，是日本独创的方法[20]。近年，日本在对酒曲的研究已经进入了分子领域，通过调控强启动子使清酒酵母中锌指蛋白MSN2的过量表达，得到对酒精耐受度更高且产酒精量更大的酵母，性能的稳定性也远强于一般控制的清酒酵母[21]。日本研究者还对实验室的清酒酵母进行优化，以实现其性能的提高，发现通过破坏编码泛素的相关基因UBI4，所得酵母能够发酵产生更多的酒精，但对于清酒酵母菌来说，UBI4基因的破坏并不足以证明酒精产量提高。这一发现也说明泛素在清酒酵母和实验室酵母中的不同作用[22]。TANIGUCHI M等[23]利用乳酸菌素的抑菌作用，成功抑制了米酒中火落菌（一种使米酒产生饭腐臭混杂醋酸味的菌）的生长，而酒曲中某些菌种能够产生乳酸菌素也被证明，这又为通过不同菌组合产生更多功能甜酒曲的制造提供了可能。
2.2韩国甜酒曲的研究
韩国传统米酒是把糯米和面粉等蒸煮后加入酒曲和水发酵而成。跟中国的米酒有类似之处，酒精度为6%vol~ 7%vol，以颜暗白和口感柔和著称。韩国对米酒的研究多为其丰富的营养作用和医疗功效[24]，对酒曲的研究并不多。韩国酿造传统米酒用的酒曲（Nuruk）是一种用小麦面或小麦粒培养，经过纯天然发酵，挤压成型的混合菌种酒曲[25]。韩国学者经研究证明，酒曲中的乳酸菌对传统米酒风味有重要影响，并对分离出的乳酸菌进行基因鉴定，通过PCR扩增得16S rRNA基因序列对比发现，酒曲中的乳酸菌与植物乳杆菌相似度达99%，且没有其他任何类似的乳酸菌株，进一步确定了韩国传统米酒中主要乳酸菌为L.plantarum RW[26]。韩国传统米酒酿造中还用到一种大麦曲，在酿酒过程中加入10%大麦曲能够提高纤溶活性和酒精的产量[27]。近年一种叫Takju的低端韩国传统米酒开始热销，Takju是一种用大米或其他谷物加上一种传统的发酵剂做成的低醇（6%vol~8%vol）未经过滤的饮料。Takju 市场的扩大，也使厂家开始追求其口味的改良和多样化。JIN J等[28]先从细胞形态上将乳酸菌初步分离，再利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对Takju中乳酸菌进行全细胞蛋白组分分析，然后将蛋白组相近的乳酸菌通过PCR扩增得到16S rRNA基因序列，对多种混合乳酸菌进行基因鉴定，为Takju的风味改进提供了依据。
2.3越南和印度甜酒曲的研究
在亚洲的很多国家，酿造型米酒都颇受百姓欢迎。越南米酒是只以糯米为原料，添加酒曲和水发酵而成。其使用的酒曲也是混合型菌种，更多的是自家手工制作而成。越南米酒的开发利用是从近年开始，还没有形成系统的体系，越南研究者从米酒中分离鉴定出Amylomyces rouxii，uxii，Rhizopus oligosporus和Rhi zopus oryzae等霉菌，这些霉菌在纯糯米糖化过程中，降解淀粉、生成葡萄糖并产生淀粉葡萄糖苷酶。与此同时，从米酒中还分离鉴定出5种酵母，并对其生理生化特性做了初步的检测[29]。由此，越南酒曲的研究也逐步开始系统化。
在印度东北部的城市，一种糯米酿造的酒精饮料很受欢迎。其是以糯米为原料，添加水和一种叫作Hamei的传统固体酒曲发酵而成的低度酒，口味独特。Hamei是一种用米天然发酵而成的天然酒曲，与印度尼西亚的“Rag”、菲律宾的“Budob”、韩国的Nuruk和锡金的“Marcha”相似[30]。印度研究者利用引物（ITS1-5.8S-ITS2）进行PCR扩增得到5.8S rRNA基因序列，然后对其转录内含间隔区（即
真核生物的内含子）进行限制性酶切分析，通过同源比对得到Hamei中酵母菌种分子鉴定结果，得出9种类型酵母：S.cerevisiae，Pichia anomala，Trichiosporon sp.，Candida-tropicalis，Pichia guilliermondi，Candida parapsilosis，Toru-laspora delbrueckii,Pichia fabianii和Candida montana。Hamei中最常见的为S.cerevisiae（32.5%）、P.anomala （41.7%）和Trichosporon sp.（8%）[31]。这也标志着印度米酒的生产已不限于家庭作坊，在向工业化迈进。
3结语
米酒这类纯粮食发酵、不经酒精勾兑和蒸馏处理的低度饮品以其诱人口感和丰富的营养价值深受人们的喜爱，有着广泛的市场开发潜力。而甜酒曲菌的组成是决定米酒好坏的核心因素，这种混合多种菌类的发酵剂带给米酒的不仅是酸甜口感、清爽酒香，更宝贵的是其在发酵过程中的代谢产物有着卓越的医疗辅助作用，米酒中抗氧化成分得到各国医学界的认可，并广泛宣传。种种特殊功效都是促使各国研究者对其菌种进行大量研究、筛选和培养的原因。中国在对甜酒曲菌研究方面，除了对菌种的生理生化特性和菌相组成的研究外，最显著的成果是对米酒凝乳霉的提纯和特性分析，这将为凝乳霉的生产提供新的更为安全的途径。在亚洲其他国家对甜酒曲的研究中，日本对酒曲的发酵性能和生长特性都有着系统地研究，并运用各种尖端的生物技术，对菌种进行筛选和基因改良，最大优化菌种某项特性，以进一步推动工业生产和拓展多样市场领域。韩国对甜酒曲的筛选鉴定使韩国传统低端米酒销量稳步提升，其中Makgeolli更远销欧美，并且在日本掀起了韩国米酒热潮。韩国对酒曲的次级代谢产物也有所研究，并运用于医学领域。越南、印度、泰国、印度尼西亚等拥有传统特米酒的国家，也相应开始运用生物手段对酒曲的菌种进行筛选和分子鉴定。各国的米类酿造酒风味不一，功效各异，且都有着悠久的酿造历史和民间传承的优质菌种。我国是米酒酿造的鼻祖，有着得天独厚的自然资源和浑厚的酿酒技艺，因此应充分借鉴其他国家的酒曲研究经验，关注各国培育的优质菌种性能，运用到我国米酒的改良中，在实现米酒的高效工业化生产同时，将中国米酒与各国民俗相结合，促进中国传统米酒的国际化发展。
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血栓栓塞导致的心脑血管疾病是当前导致人类死亡的主要原因之一，利用纤维蛋白溶解酶（纤溶酶）溶解血栓，使血管再通的溶栓疗法是目前这类疾病最为有效的手段。自从日本学者SUMI H等[1]从纳豆中分离到具有强烈纤溶活性的纳豆激酶，韩国学者KIM W等[2]从韩国传统食品Chungkook-Jang中分
离到纤溶酶CK11-4，我国研究人员在豆豉、酱油等传统大豆发酵食品中也分离出具有纤溶活性的酶[3]，其中分离自豆豉的纤溶酶因具有很强的活性和很好的抗凝、溶栓作用，故命名为豆豉纤溶酶（也有人称溶栓酶、豆豉激酶）。豆豉纤溶酶作为从传统食品中发现的一种潜在的新型溶栓药物，与传统的溶栓剂相比，具有血栓溶解能力强、活性高、安全性好、不引起内出血、在体内半衰期长，药效持久、分子量小、可以通过消化道直接吸收等优点，而且应用微生物技术生产纤溶酶酶具有周期短、产量高、工艺简单、成本低等特点，应用前景广阔。1菌株的筛选、诱变与菌种鉴定
豆豉是我国传统发酵食品，向梅等[4]从豆豉中筛选出产纤溶酶的高产菌株，经鉴定为芽孢杆菌属枯草杆菌细菌。彭勇等[5]从豆豉中分离出2株具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC-2和DC-4，基因和分子水平研究表明，DC-2菌株与日本的纳豆杆菌同属一个菌，而DC-4菌株属于分解淀粉芽孢杆菌，即豆豉纤溶酶产生菌并非一种，从而在特性上可能存在一定差异。为了提高菌株的产酶能力，目前许多学者[6-7]采用紫外线、60Co、亚硝基呱、硫酸二乙酯等物理和化学的方法对目标菌株进行诱变。
2发酵工艺
豆豉纤溶酶的发酵工艺有固态法和液态法。固体发酵大都是在煮熟的大豆上接种菌种，经培养后提取纤溶酶。黎金兰等[8]对固体发酵法生产豆豉纤溶酶的工艺进行了优化，确定了菌株的最佳产酶条件。液体发酵的工艺则是在液体培养基中接种菌种，经过发酵后提取纤溶酶。崔堂兵等[9]对豆豉纤溶酶产生菌的液体发酵条件进行优化，生产纤溶酶的活力为2345U/mL。
3酶的纯化、分子生物学和酶学特征
3.1豆豉纤溶酶的分离纯化
酶的分离纯化可以采用过滤、离心、盐析、超滤、凝胶过滤和层析分离等多种方法，王成涛等[10]采用凝胶层析法得到电泳纯的纤溶酶Subtilisin FS33。齐海萍等[11]将淡豆豉浸提液经过硫酸铵沉淀、CM-Sepharose-FF离子交换谱和Sephacryl S-200凝胶过滤等纯化步骤，得到豆豉纤溶酶单体酶。
3.2豆豉纤溶酶的分子生物学
豆豉纤溶酶的功能及应用前景
孙月娥，王卫东
（徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008)
摘要：豆豉纤溶酶源于中国传统发酵食品豆豉，具有溶解血栓等功能，是一种可以作为潜在溶栓药物的纤维蛋白酶。对豆豉纤溶酶的研究现状和应用前景进行综述，为开发新型溶栓药物指明了方向。
关键词：豆豉纤溶酶；功能；应用前景
中图分类号：Q555文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）09-0025-03
Functions and application prospect of Douchi fibrinolytic enzyme
SUN Yue'e,WANG Weidong
(College of Food Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou221008,China)
Abstract:Douchi fibrinolytic enzyme,which has fibrinolytic activity and could be used as thrombolytic agent,is isolated from Douchi,a traditional Chinese soybean product.Present research progress and application prospect of Douchi fibrinolytic enzyme were reviewed,which would provide a promising direction of new thrombolytic medicine development.
Key words:Douchi fibrinolytic enzyme;function;application prospect
收稿日期：2010-02-07
作者简介：孙月娥（1973-），女，讲师，吉林图们人，研究方向为功能性食品。
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