Antioxidant Activity In Vitro of Total FlavonoidsFrom Cortex Juglandis Mandshuricae
YAN Ming-xue， WANG Qian-qian， YANG Ming-zhe， XUE Wen-jing， SHI Lei， ZHAO Pan*
（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）
核桃楸（Juglandis Mandshuricae）属胡桃科胡桃属植物，主要分布于我国东北、华北地区，是十分珍贵的药源植物，开发应用前景广阔[1]。核桃楸皮（Cortex Juglandis Mandshuricae）为核桃楸的茎皮和枝皮[2]，富含黄酮类、醌类、萜类、二芳基庚烷类、多酚类等多种化学成分[3]，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性[4]，在食品、药品等领域都具有较大的开发价值。
黄酮类化合物普遍存在于自然界中，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、调节免疫等多种药理活性[5]，但目前针对核桃楸皮的研究多集中在醌类物质及抗肿瘤方面，对核桃楸皮总黄酮抗氧化活性的研究少见报道[6-7]。因此，加快核桃楸皮总黄酮抗氧化活性的研究，对核桃楸皮的深度开发与利用具有重要的经济效益和社会效益。史磊
GFL-230型电热鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;QE-300型高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司;FA1204B电子天平，上海天美天平仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司;DLSB-ZC型低温循环真空泵，郑州长城科工贸有限公司;YRE-501型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司;KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;LGJ-18型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公
司;UV9100B型紫外可见分光光度计 ，北京莱伯泰科仪器有限公司;TDL80-2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂;PHS-25型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。
核桃楸皮，安国市昌达中药材饮片有限公司;HPD-750型大孔树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司;标准品芦丁，中国科学院成都生物研究所研制;抗坏血酸，天津市福晨化学试剂厂;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、DPPH、无水乙醇、浓盐酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁、三、三氯化铁，均为国产、分析纯。
绘制芦丁标准曲线采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显法，参考李学玲[8]等的方法稍做改变。取2 mL 200 µg·mL-1芦丁标准溶液置于10 mL容量瓶中，加入质量分数为5% 的NaNO2 溶液0.5 mL，摇匀后静置8 min;再加入质量分数为10% 的Al（NO3）3 溶液0.5 mL，摇匀后静置6 min;然后加入质量分数为4% 的NaOH溶液4.0 mL，质量分数为70%的乙醇定容，摇匀后放置10 min，以不加芦丁标准溶液为空白调基线，用紫外分光光度计在200～800 nm内进行光谱扫描，确定其最大吸收波长为510 nm。光谱扫描如图1所示。
准确量取芦丁标准溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按
上述操作步骤进行显反应，以不加芦丁标准溶液为空白，在510 nm处测量吸光度。绘制芦丁标准曲线如图2所示。
参考何微[9]等的总黄酮提取工艺稍做修改。将干燥至恒重的核桃楸皮粉碎，过100目筛（孔径 0.15 mm）得核桃楸皮粉末307.7 g，加入15倍量质量分数为70%的乙醇，在80 ℃水浴下回流提取 1.5 h，提取两次。将提取液抽滤，合并两次滤液，得核桃楸皮粉末的醇提液。将醇提液用旋转蒸发仪在60 ℃下减压回收乙醇至无醇味，即得。
大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、吸附速度快、选择性好、再生处理方便等优点，被广泛应用于中草药化学成分的提取、分离、纯化工作中[10]。大孔吸附树脂的吸附性是其与被吸附物质分子间的范德华力以及形成氢键而产生的，即一种通过巨大的比表面积而进行的物理吸附。由于提取液中的化学成分复杂繁多，分子量和吸附力各不相同，因此被吸附成分经过一定的溶剂洗脱，可以先后从大孔树脂上被洗脱下来，达到分离、纯化物质的目的[11]。本实验经过前期实验，选用HPD-750型大孔树脂对核桃楸皮总黄酮进行纯化。控制上样质量浓度约5 mg·mL-1，样液以2 BV/h的流速流过树脂柱，最大上樣量7 BV，静置，吸附4 h后用蒸馏水淋洗树脂柱至流出液澄清，再用8 BV体积的质量分数为70%的乙
醇进行洗脱，收集洗脱液。
将核桃楸皮总黄酮纯化后的洗脱液在60 ℃下减压旋蒸，得到核桃楸皮总黄酮浓缩提取液，经冷冻干燥后得核桃楸皮总黄酮粉末31.70 g。
取黄酮粉末5.3 mg，用质量分数为50%的乙醇定容到25 mL容量瓶中，得到总黄酮溶液。移取5 mL总黄酮溶液于25 mL容量瓶中，加入质量分数为5% 的NaNO2溶液0.5 mL，摇匀后静置8 min;再加入质量浓度为10%的 Al（NO3）3 溶液0.5 mL，摇匀后靜置6 min;然后加入质量分数为4% NaOH溶液4.0 mL，质量分数为50%的乙醇定容，即得待测样品。以质量分数为50%的乙醇为空白，在510 nm处平行3次测得吸光度为0.424 4±0.009 2，利用工作曲线计算样品质量浓度为（30.53±1.70）µg·mL-1。最终计算得到核桃楸皮总黄酮粉末的纯度为（72.02±4.01）%。
式中：C —待测样品的质量浓度，µg·mL-1;
V — 待测样品的体积，mL。
参考杨永涛[12]的方法，并稍加修改。精确称量黄酮粉末0.013 9 g，质量分数为50%的乙醇定容到100 mL容量瓶中，得质量浓度为100 µg·mL-1的核桃楸皮总黄酮溶液，分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL总黄酮溶液于25 mL容量瓶中，质量分数为50%的乙醇定容，得到质量浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16 µg·mL-1的核桃楸皮总黄酮溶液。分别取上述不同质量浓度溶液 2 mL，置于8个10 mL比管中，然后分别加入 0.1 mmol·L-1 DPPH溶液2 mL，混合摇匀，37 ℃水浴下避光放置30 min后，于517 nm处测定吸光度值Ax，以2 mL无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度A1，以2 mL无水乙醇代替样品溶液，测得吸光度 A0。每一吸光度平行测定3次，取平均值。以相同质量浓度的VC作阳性对照。以质量浓度为横坐标，对DPPH自由基的清除率为纵坐标，绘制工作曲线。对DPPH自由基的清除率计算公式如下：
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