葡萄酒中抗氧化物质及检测方法
姓名：冯朝朝
指导老师：阎贺静
河北科技师范学院食品科技学院酿酒工程专业
摘要： 目的: 建立高效液相谱.二苯基三硝基苯肼 在线法评价葡萄酒清除自由基的活性，研究其抗氧化活性物质基础  方法: 葡萄酒样品经分离，在柱后与工作液在三通处混合，于管中充分反应后，流经检测器记录反应信号，以水溶性维生素类似物为标准计算活性成分的抗氧化当量，比较不同地区葡萄酒总抗氧化能力及活性成分差异；  结果: 通过定性分析得出葡萄酒样品中没食子酸、原儿茶酸、原花青素、咖啡酸和没食子酸乙酯对自由基具有清除活性自由基的作用，但原花青素二聚体香草酸、丁香酸和对香豆酸没有清除活性自由基的作用，不同地区葡萄酒总抗氧化能力不同，所含抗氧化活性成分也有较大差异，其中原花青素二聚体与没食子酸活性最强，目的: 建立高效液相谱.二苯基三硝基苯肼 在线法评价葡萄酒清除自由基的活性，研
究其抗氧化活性物质基础  方法: 葡萄酒样品经分离，在柱后与工作液在三通处混合，于管中充分反应后，流经检测器记录反应信号，以水溶性维生素类似物为标准计算活性成分的抗氧化当量，比较不同地区葡萄酒总抗氧化能力及活性成分差异；  结果: 通过定性分析得出葡萄酒样品中没食子酸、原儿茶酸、原花青素、咖啡酸和没食子酸乙酯对自由基具有清除活性自由基的作用，但原花青素二聚体香草酸、丁香酸和对香豆酸没有清除活性自由基的作用，不同地区葡萄酒总抗氧化能力不同，所含抗其次是儿茶素和未知物，活性较弱的是咖啡酸#原儿茶酸和没食子酸乙酯；  结论: 葡萄酒中含有多种抗氧化活性物质;    该法能够实现对天然产物抗氧化活性的分析，具有在线无损高通量筛选快速分析的特点。
关键词：葡萄酒；抗氧化活性；测定方法
  人们的生活水平一直在不断提高，葡萄酒也渐渐地在中国得到普及和流行，它已经发展成为新时代大众所喜爱的时尚饮品。适量的消费葡萄酒可以降低心血管疾病、动脉粥样硬化、血小板聚集和癌症等多种疾病的发病率。葡萄酒的各种保健功效被认为与这些物质的抗氧化能力有关。我国葡萄酒工业以及葡萄酒市场正在不断地发展，并且这一趋势将会不断扩长。但目前为止，系统地研究我国葡萄酒的主要抗氧化成分和抗氧化能力的研究非常少。对于葡
萄酒抗氧化能力的研究可以很好的评价葡萄酒的质量，为消费者提供参考，并且为葡萄酒的工艺措施改革提供理论依据。然而，由于抗氧化自身的复杂性和反应机制的多重性，使得目前没有一种标准方法可以代替和概括其它测定方法。抗氧化活性测定方法按照分析原理有不同的分类,根据是否进行生物体试验可以分为：体内试验和体外试验；根据测定目标是否为酶可以分为：酶法测定和非酶法测定；根据反应机理不同可以分为：以供氢为机理的方法、以供电子为机理的方法和兼有二者的方法；根据实验所用仪器可分为：分光光度计法、荧光法、化学发光法、谱法等。高效液相谱二苯基三硝基苯肼在线技术不但避免了上述方法的不足，而且还可实现见图识效的作用，快速高效、直观、准确，对揭示葡萄酒抗氧化物质基础以及对葡萄酒的质量
控制具有重要意义。
1、葡萄酒中的多酚抗氧化活性物质
多酚物质是含有酚羟基的物质。从化学结构上讲，是苯环上联有一个或多个羟基的化合物。葡萄和葡萄酒中的多酚物质按其化学结构可分为两大类：类黄酮和非类黄酮；按分子质量可以分为单宁化合（相对分子量为500～3000u）和非单宁化合物（相对分子量小于500u或大
于3000u）；按其颜分为素和无多酚两大类。指纹图谱库在线法检测抗氧化活性物质。
谱条件 谱柱:柱温30℃ ，流动相：A甲醇  B ：%磷酸溶液 程序洗脱：40-57min80%-78%B 57-75min78%-70%B 75-80min70%-60%B 80-81min60%-90%B检测波长280nm ；进样量20ul ；流速1ml/min
检测波长谱峰鉴别    从构建的干红葡萄酒多酚物质的指纹图谱库中选取容易得到的没食子酸#原儿茶酸#龙胆酸#儿茶素#香草酸#咖啡酸#丁香酸和中选取容易得到的没食子酸#原儿茶酸#龙胆酸#儿茶素#香草酸#咖啡酸#丁香酸和对香豆酸对照品,配制适当浓度的混合标准溶液，按上述谱条件，进 HPLC分析，并用 进行选择离子检测，以没食子酸为参照峰，比较相对保留时间，最大吸收波长和分子离子鉴定谱峰.
抗氧化活性分析  选择 Trolox 为对照标准体系，配制成一系列梯度浓度的 Trolox 溶液，注入HPLC-DPPH系统，进样量20ul，以倒峰峰面积( Y)为纵坐标， Trolox浓度( X) 为横坐标，绘制标准曲线,将各供试品溶液中谱峰相对应的倒峰峰面积代入该线性方程，算出此物质Trolox 当量，并分析葡萄酒抗氧化活性的物质基础。
2、葡萄酒中的原花青素(OPC)
OPC是目前国际上公认的、目前为止所发现的、清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。其抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并吸收迅速完全，可以预防心血管疾病和癌症。
2．1实验材料、试剂
葡萄酒样品原花青素标准样（95%）：葡萄籽提取物、甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁胺均为分析纯。
盐酸-正丁醇溶液：盐酸与正丁醇按95：5的体积比混合。
硫酸铁胺（NH4Fe(SO4)2·12H2O）溶液：用浓度为2mol/L盐酸配成2%的溶液。
2．2实验仪器UV-2401紫外分光光度计(SHIMADZU公司)；AS3120超声波清洗器；水浴锅。
实验方法
标样的制备称取原花青素标准样50mg于50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，静置至室温，以甲醇定容。
试样的制备将待测葡萄酒摇匀后，吸取适量葡萄酒，置于100ml容量瓶中，以甲醇定容，摇匀。
标准曲线吸取标样溶液、、、置于10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。吸取上述溶液各1ml，按试样测定方法测定后，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标计算标准曲线。
试样测定方法加入盐酸正丁醇溶液6ml、硫酸铁铵溶液、1ml试样溶液于10ml棕容量瓶中，混匀，用聚四氟乙烯带，把瓶口缠严，置沸水浴中，精确加热40分钟后，立即置冰水浴中冷却15分钟，然后于546nm波长处测吸光度，由标准曲线计算试样中原花青素含量。
3、葡萄酒中的白藜芦醇(Resveratrol)
白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可以延缓衰老，降低血液的粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，预防癌症的发生及发展，还具有抗动脉粥样硬化的作用对冠心病、缺血性心脏病、高血脂有防治作用，并且对乳腺癌等疾病有所帮助
白藜芦醇通常采用红外光谱进行定性检测，所得到的白藜芦醇红外光谱在3250cm-1处有吸收峰在1620cm-1、1540cm-1、1500cm-1处有苯环吸收峰,在965cm-1
处有反式特征吸收，700cm-1处为顺式的特征吸收由此可判断白藜芦醇的结构。
4、葡萄酒中的单宁(Tannin)
单宁具有抗氧化作用，是一种天然防腐剂。有关医学研究表明，红葡萄酒的单宁物质对人体健康十分有益，可有效降低血脂胆固醇，防治血管硬化，并具有抗辐射的作用。 通常用福林--丹尼斯法来测定葡萄酒中单宁的含量。
试剂的配制：
    福林-丹尼斯试剂：在750ml水中加入100g的钨酸钠，20g的磷钼酸以及50ml的磷酸，回流两个小时，冷却，稀释至1000ml。
    碳酸钠饱和溶液：每100ml水中加入40g无水碳酸钠，放置过夜。次日加入少许水合碳酸钠作为晶种，是结晶析出用玻璃棉过滤后备用。
    单宁酸饱和溶液：称取单宁酸，用水溶解，定容至100ml。
标准曲线的制备及单宁含量测定
分别吸取0ml、、、、、、、10ml单宁酸标准溶液用水定容至50ml。分别取上述溶液1ml加入含有70ml水的100ml容量瓶中，加入福林丹尼斯试剂5ml及饱和碳酸钠溶液10ml，加水至刻度充分混匀。30分钟后以空白作参比，在波长760nm处测吸光度。绘制标准曲线，以吸光值为纵坐标，以上述单宁酸浓度为横坐标绘制标准曲线。
吸取1ml的葡萄酒上清液，至于70ml水的容量瓶中，加入5ml福林丹尼斯试剂及10ml的饱和碳酸钠溶液，加水至100ml,充分混匀。30分钟后测定吸光度，从标准曲线上查出相应的单宁含量。
讨论：由于葡萄酒的抗氧化机理复杂,在反应过程中抗氧化反应和促氧化反应可能同时存在,只有在适宜稀释倍数时葡萄酒的抗氧化活性才能得以体现。不同反应时间测定的TEAC值也有差异,这是由于葡萄酒中的抗氧化活性物质与ABTS+的反应产物会引起一些副反应发生,从而影响葡萄酒的抗氧化活性,因此时间过短或者过长会导致抗氧化活性值被低估或高估,只有
只有在一定的反应时间段,TEAC值才能客观地反应葡萄酒的抗氧化活性。ABTS+法作为近年来被广泛采用的抗氧化活性测定方法,其本身也存在缺陷,不同的产生机理和产生体系得研究成果难以横向比较,ABTS+工作液在反应前的稀释标准各文献报道也不同。因此,ABTS+法还有待在以上诸领域进行进一步的研究和完善。
干红葡萄酒的功效与作用
参考文献：
1、白藜芦醇及其检测方法的研究余淑娴,郑湘娟,胡六根,陈丽萍,洪三国南昌大学化学系,江西南昌330047