2021年第38卷第6期
广西中越边境地区蜱种类分布
及其非洲猪瘟病毒携带情况调查何成伟1，万道正1，钟　勇1，蓝翊文1，廖才伟2，龙书汉2，韦景耀1，叶海波3
（1. 凭祥海关，广西凭祥　532600；2. 南宁海关，广西南宁　530029；
3. 东兴海关，广西东兴　538100）
摘　要：为了解广西中越边境地区蜱的种类分布及其非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）携带情况，采用布旗法捕捉游离蜱，直接法采集动物体表的寄生蜱，进行分类鉴定，同时采用荧光PCR方法检测ASFV核酸。结果显示：共捕获222只蜱，经鉴定属于2科5属8种，包括7种硬蜱、1种软蜱（蝙蝠锐缘蜱）；优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱，没有捕捉到与传播ASFV相关的钝缘蜱；所有捕获的蜱未检测出ASFV核酸。结果表明，广西中越边境地区以硬蜱分布为主，蜱携带传播ASFV的风险较低，但鉴于该地区的疫情形势、家猪养殖模式以及野猪分布，蜱在ASFV传播和储存方面仍存在潜在风险。今后，需要进一步扩大蜱捕捉区域，深入开展蜱种类分布调查及其ASFV携带情况监测。
关键词：中越边境；蜱；非洲猪瘟病毒；核酸检测
中图分类号：S851.3  文献标识码：A  文章编号：1005-944X（2021）06-0031-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.06.007
Investigation on Ticks and Their ASFV Carrying Situation in
China-Vietnam Border Regions in Guangxi
He Chengwei1，Wan Daozheng1，Zhong Yong1，Lan Yiwen1，
Liao Caiwei2，Long Shuhan2，Wei Jingyao1，Ye Haibo3
（1. Pingxiang Customs，Pingxiang，Guangxi　532600，China；
2. Nanning Customs，Nanning，Guangxi　530029，China；
3. Dongxing Customs，Dongxing，Guangxi　538100，China）
Abstract：In order to identify the distribution of tick species and their status of carrying African swine fever virus（ASFV）in China-Vietnam border regions in Guangxi，free ticks were captured by cloth flags and parasitic ticks were collected directly from body surface of animals for classification and ident
ification. Meanwhile，ASFV nucleic acids were detected by fluorescent PCR. The results showed that，a total of 222 ticks fell into 8 species，5 genera and 2 families，including 7 species of ixodes as well as 1 species of argasidae of Argas（Carios）vespertilionis；microplus boophilus and ixodes granulates were dominant，and no turicata contributing to the spreading of ASFV was captured；and no ASFV nucleic acid was detected out from all captured and collected ticks. It was concluded that ixodes were widely distributed in China-Vietnam border regions in Guangxi，and their risk of spreading ASFV was relatively low，which，however，had brought potential risk to the spreading and storage of ASFV in view of local status of the epidemic，pig production mode and distribution of wild boars. In the future，it would be necessary to further expand the range for capturing ticks，investigate the distribution of all species of ticks and to monitor their status of carrying ASFV.
Key words：China-Vietnam border；tick；ASFV；nucleic acid detection
收稿日期：2021-02-25　修回日期：2021-03-31
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪烈性传染病。该病2018年8月首次发现于我国辽宁省，随后疫情从东北地区迅速蔓延至全国各地，对
我国养猪业造成了不可估量的经济损失。2019年2月20日，越南向世界动物卫生组织（OIE）首次报告发生ASF疫情，其后疫情席卷越南全境。与越南毗邻的我国广西也于2019年2月发生了首例ASF疫情。蜱在ASFV传播过程中扮演着重要角。ASFV 可在钝缘蜱属（Ornithodoros）的软蜱体内复制，从而使蜱成为病毒的储存库，经叮咬可引起猪感染[1]。据刘建等[2]推测，软蜱最适生长温度为22~30 ℃，最适湿度为75%~95%。广西属亚热带季风气候区，全年平均气温为16.5~23.1 ℃，雨水丰沛，季节变化不明显，很适合蜱繁殖。目前关于广西蜱种类的报道始见于廖国厚等[3]的硬蜱调查，但至今未见关于软蜱的报道。鉴于ASFV 可在蜱体内长期存在，而且可在野猪-蜱-家猪三者间循环传播，因而不能忽视蜱传播ASFV的潜在风险[2]，尤其是广西。为了解广西中越边境地区蜱的种类分布及其ASFV携带情况，开展了此次流行病学调查，以期为广西中越边境地区ASF防控决策提供依据。
1　材料与方法
1.1　蜱捕捉地点及时间
广西地处边陲，有8个市（县）与越南毗邻，山水相连，没有天然屏障。边境线长1 026 km，有194条通道可通行机动车辆。本次蜱采集区域主要靠近中越边境线，包括东兴市马路镇、东兴镇、峒中镇，宁明县爱店镇、桐棉镇，龙州县水口镇、武德乡，凭祥市友谊镇、凭祥镇、上石镇，靖西市龙邦镇、宁安乡，那坡县平孟镇。捕捉时间为2019年6月—2020年11月。
1.2　蜱采集方法
1.2.1　游离蜱　采用布旗法，用90 cm×60 cm的白布旗，在调查区域内定时拖蜱。手持旗杆伸向一侧，使旗子平铺于草丛上，等速缓步前行，每步行10 m停下观察1次，将附于旗上的蜱捡入容器内，带回实验室统计捡获蜱总数，同时进行蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。
1.2.2　寄生蜱　采集鼠、狗、牛、羊、蝙蝠等动物体表寄生蜱于容器内，带回实验室统计捡获蜱总数，以及蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。
1.3　蜱分类鉴定
按《中国国境口岸病媒生物及动物虫媒病》[4]和《中国国境口岸医学媒生物鉴定图谱》[5]进行。
1.4　ASFV核酸检测
ASFV核酸检测，比如样品处理、核酸提取等，严格按照《实验室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）执行[6]。
1.4.1　仪器和试剂　全自动核酸提取仪（型号GeneRotex96），西安天隆科技有限公司提供；荧光定量PCR仪（型号Quantstudio 7 Flex），美国ABI公司提供；病毒DNA/RNA提取试剂盒（批号20082320T0
14、20112510T014），西安天隆科技有限公司提供；荧光PCR快速检测试剂盒（批号20191102、20200803），郑州中道生物技术有限公司提供。
1.4.2　蜱处理　将整只蜱置于组织匀浆器中充分研磨，加入1 000 IU/mL的青霉素、1 000 µg/mL 的链霉素[7]、0.1 mol/L的灭菌PBS（pH7.4），制备10%组织匀浆液，2 000 r/min离心处理10 min，取上清液，标记编号，立即进行ASFV检测或冷冻储存备用。
1.4.3　引物和探针　针对ASFV B646L基因保守序列[7]设计引物和探针。上游引物VP72-F1：5'-GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCT-3'；下游引物VP72-R1：5'-CCGTAGTGGAAGGGTATG-TAAGAG-3'：Taq Man探针VP72-T1：FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQ1。
1.4.4　核酸扩增　按试剂盒说明书进行。扩增条件：50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性3 min；预扩增，95 ℃变性5 s，55 ℃退火延伸30 s，5个循环；扩
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2.2　ASFV 核酸检测
所有的222只蜱，经荧光PCR 方法检测，均为ASFV 核酸阴性（图2）。3　讨论
ASF 是由虫媒双链DNA 的ASFV 引起猪高死亡率的病毒性疫病，自2018年8月传入我国以来，给我国养猪业造成了严重经济损失。我国对防控ASF 十分重视，出台了多条政策，实施各种措施提高ASF 防控能力，控制ASF 的肆意传播，取得了阶段性效果。到2020年底，我国生猪产能已恢复到2017年底的90%以上。由于目前尚未有
ASFV 疫苗，因此防控ASF 形势仍然严峻。东兴疫情最新消息
据报道[8]，ASFV 可在蜱体内持续存活几个月到5年。软蜱科中的钝缘蜱属（Ornithodoros ）是
增，95 ℃变性5 s ，55 ℃退火延伸30 s ，40个循环。荧光通道选择FAM ，在扩增阶段每个循环的55 ℃时收集荧光信号。设置扩增体系为25 µL ，同时选择passive reference 和quencher 为none 模式。1.4.5　结果判定　（1）基线和阈值设定。基线调整取6~15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好过阴性对照检测荧光曲线的高点为原则。（2）质量控制。阴性对照应无特定扩增曲线，且Ct ＞38.0或无；阳性对照Ct ≤30.0，且扩增曲线明显；否则试验视为无效。（3）样品判定。待检样品荧
光信号有指数型增加，且Ct ＜35.0，为阳性；未检测到Ct 或Ct ＞38.0或无明显扩增曲线，则为阴性；35.0≤Ct ≤38.0时，复检1次，复检结果为阳性则判定为阳性，否则为阴性。2　结果2.1　蜱分类鉴定
共捕捉蜱222只，经分类鉴定属于2科5属8种；区域分布广泛，优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱。222只蜱中，有7种硬蜱，只有1种软蜱且只在蝙蝠身上捕捉到（表1）。部分蜱种鉴定照片见图1
。
科
属
种
数量/只地点
硬蜱科（Ixodidae ）硬蜱属
（Ixodes ）
粒型硬蜱（Ixodes granulatus ）47宁明县桐棉镇板栏村（30只），东兴市马路镇三龙村（17只）全沟硬蜱（Ixodes persulcatus ）33凭祥市友谊镇浦寨（21只），龙州县水口镇板棒村（12只）
中华硬蜱（Ixodes sinensis ）
18靖西市龙邦镇叫必村革蜱属
（Dermacentor ）森林革蜱（Dermacentor silvarum ）16凭祥市凭祥镇叫隘村中华革蜱（Dermacentor sinicus ）17宁明县爱店镇那逢村血蜱属
（Haemaphysalis ）亚洲血蜱（Haemaphysalis asiatica ）
29东兴市东兴镇江那村
牛蜱属
（Boophilus ）
微小牛蜱（Boophilus microplus ）
53宁明县桐棉镇板邦村（29只）；凭祥市友谊镇板茶村（13只）；靖西市宁安乡弄利村（11只）
软蜱科（Acarina ）锐缘蜱属
（Argas ）
蝙蝠锐缘蜱（Argas vespertilioni ）
9
龙州县武德乡科甲村
A. 全沟硬蜱（Ixodes persulcatus ）；
B. 微小牛蜱（Boophilus microplus ）；
C. 亚洲血蜱（Haemaphysalis asiatica ）；
D. 粒形硬蜱（Ixodes granulatus ）
图1　部分蜱种鉴定照片
ASFV极为重要的自然宿主和储存宿主[9]。此类蜱叮咬了被ASFV感染的猪时便会携带此病毒，当其再次吸血时就会导致该病传播。历史上，在ASF 传播中，钝缘蜱担当了重要角[10]。比如，20世纪60年代，西班牙和葡萄牙的ASF疫情流行中，软蜱充当了重要的媒介和储存宿主作用[11-12]。软蜱寿命很长，有资料介绍可生存20年，大多数ASFV野毒株可在软蜱体内持续存活，可长达8年甚至终生[10]。一
旦ASFV侵入蜱的生存循环圈，将对家猪带来长期威胁，难以根除。1957年ASF 传入葡萄牙，直到1993 年底才被净化，历时36年。1999年11月，葡萄牙南部Alentejo省一农场复发ASF疫情。调查发现，疫情发生是因猪舍内游走的钝缘蜱，而这距离最后一次疫情将近6年时间[13]。经对葡萄牙暴发的ASF疫情进行调查，发现扑灭疫情后2.50~5.25年仍有8.8%的猪场存在感染ASFV的蜱[13]。
广西蜱种类繁多，据报道[3]，已发现6属11种：爪哇花蜱（Am. javanense）、巴氏盲花蜱（Ap. barbouri）、厚体盲花蜱（Ap. crassipes）、微小牛蜱（B. microplus）、缅甸血蜱（H. birmaniae）、具角血蜱（H. cornigera）、嗜鸟血蜱（H. ornithophila）、粒形硬蜱（I. granulatus）、卵形硬蜱（I. ovalus）、镰形扇头蜱（R. haemaphysaloides）、短小扇头蜱（R. pumilio）。此次调查于蝙蝠上捕捉到了蝙蝠锐缘蜱，表明广西中越边境地区有软蜱分布，但没有捕捉到传播ASFV风险较高的钝缘蜱。今后要扩大蜱的捕捉区域，争取捕到更多的属种，以确定广西蜱的种类分布。本次调查捕捉到的蝙蝠锐缘蜱的ASFV传播作用，有待今后进一步研究。
本次调查未在捕捉到的蜱中检测到ASFV，但广西和越南家猪中存在ASF疫情，且中越边境线上有一些散养的野猪与家猪杂交品种。这些杂交品种猪都是放养的，是实际意义上的丛林猪，和野猪生境差不多，因此存在病毒进入此循环圈的风险，今后需要继续加强对这些猪及蜱的ASFV监测。4　结论
调查发现，广西中越边境地区以硬蜱分布为主，但也存在软蜱；虽然未在捕获的蜱中检出ASFV，但鉴
于该地区疫情形势、家猪养殖模式以及野猪分布，蜱在ASFV传播和储存方面的潜在风险依然存在。因此，需要进一步扩大区域，继续
1~2. 阳性对照；3. 阴性对照；4~225. 蜱样品。
图2　222只蜱的ASFV核酸检测结果
（下转第43页）
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场调查未发现饲料霉变。结合该病的流行病学特征推测，此次病情由饲喂过多的精料引发。调查后建议停止饲喂精料，跟踪发现未再出现死亡病例，病情得到了有效控制，由此验证了病因假设。
3.2　局限性
一是调查介入时间较晚，没有对每头死亡牛只进行解剖，无法确保死亡牛只都是因瓣胃阻塞而死亡，导致实际病例数与推断数之间存在误差；二是现场调查发现，该病情与传染病的联系较小，所以未进行采样检测，故无法排除与细菌、病毒等病原混合感染的可能。
3.3　警示
该起牛死亡事件警示，应加强牛饲养管理，确保饲料配比合理，在饲喂精料时应逐渐过渡，并严格控制精料饲喂量；在饲料和饮水中应适当添加维生素和微量元素，促进胃肠蠕动，提高消化能力；在牛瓣胃阻塞时，需要根据不同发病阶段选择相应的措施。
4　结论
调查分析认为，该牛场水牛死亡事件是因突然改变饲料成分，饲喂过多精料引起的瓣胃阻塞导致的。由此建议牛场精料配比要合理，同时加强牛只运动，保证充足饮水。
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（责任编辑：朱迪国）
开展蜱的调查及其ASFV携带情况监测。
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（责任编辑：侯文婷）
（上接第34页）