54卷
杜普旋1，陈荣华2，邓权清1，鲁清1，刘浩1，范呈根2，李少雄1，洪彦彬1*
（1广东省农业科学院作物研究所/国家油料作物改良中心南方分中心/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东广州510640；
2赣州市农业科学研究所，江西赣州341000）
摘要：【目的】分离筛选高效结瘤固氮的花生根瘤菌，为花生根瘤菌的田间推广应用提供理论依据和候选菌种。
【方法】采用植物捕获法从田间采集的土样中分离纯化根瘤菌，扩增其16S rDNA序列进行分子鉴定。经回接试验和匹配试验筛选优良菌株及最佳共生组合，并通过土壤盆栽田间试验探究优良菌株的接种效果。【结果】共分离纯化出15株花生根瘤菌，均属于α-变形菌纲的慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）。回接试验筛选出2株共生固氮性状优良的花生根瘤菌GDHS-5和GDHS-14。匹配试验表明这2个菌株具有广谱结瘤性，GDHS-5与粤油901的匹配效果最好，GDHS-14次之。土壤盆栽条件下接种GDHS-5显著提高了粤油901的地上部分高度、根瘤数量和根瘤鲜重（P<0.05，下同），而接种GDHS-14与不接种对照（CK）无
显著差异（P>0.05，下同）。田间条件下接种GDHS-5分别使单株荚果数、产量和花生蔗糖含量显著增加35.82%、9.92%、165.88%，接种GDHS-14与CK无显著差异。【结论】花生根瘤菌GDHS-5和GDHS-14共生固氮表现优异，其中GDHS-5能高效共生固氮，具有广谱结瘤性，在田间条件下可显著提高花生单株荚果数和产量，具有较大的田间应用潜力。
关键词：花生；根瘤菌；共生固氮；分离筛选
中图分类号：S565.2；Q939.9文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）01-0102-08
Isolation，screening and application of peanut rhizobia
DU Pu-xuan1，CHEN Rong-hua2，DENG Quan-qing1，LU Qing1，LIU Hao1，
FAN Cheng-gen2，LI Shao-xiong1，HONG Yan-bin1*
（1Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/South China Peanut Sub-center，National Cen-
ter of Oilseed Crops Improvement/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Guangzhou，
Guangdong510640，China；2Institute of Agricultural Sciences in Ganzhou，Ganzhou，Jiangxi341000，China）
Abstract：【Objective】To isolate and screen peanut rhizobia of efficient nodulation and nitrogen fixation effects，and to provide theoretical basis and candidate strains for promotion and application of peanut rhizobia in field.【Method】Rhi-zobia were isolated and purified from soil samples collected in field by plant capture method，and their16S rDNA sequen-ces were amplified for molecular identification.Excellent rhizobia strains and optimal symbiotic combination were screened by reinoculation and matching tests，and effects of inoculation with the excellent strains were investigated through soil pot field tests.【Result】Fifteen strains of peanut rhizobia were isolated and purified，all belonging to Bradyrhi-zobium ofα-proteobacteria.Two strains of peanut rhizobia，GDHS-5and GDHS-14，with excellent symbiotic nitrogen fi-xation traits were screened through the reinoculation test.The matching test showed that these2strains had broad-spectrum nodulation，and matching Yueyou901with GDHS-5produced the best effects，followed by matching it with GDHS-14.
Under soil pot culture conditions，inoculation with GDHS-5significantly increased above-ground part height，root nodule number and root nodule fresh weight of Yueyou901（P<0.05，the same below），but no significant difference was found be-tween strains inoculated with GDHS-14and non-in
oculated control（CK）（P>0.05，the same below）.Pod number per plant，yield and sucrose content in peanut were significantly increased by35.82%，9.92%and165.88%respectively after inoculation with GDHS-5under field conditions，and no significant difference was found between strains inoculated with
收稿日期：2022-10-20
基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2022B020*******）；广东省科技计划项目（2021A0505030047）；广东省现代农业产业技术体系项目（2022KJ136-02）
通讯作者：洪彦彬（1979-），https：///0000-0002-8589-8184，研究员，主要从事花生遗传育种研究工作，E-mail：hongyan-************
第一作者：杜普旋（1996-），https：///0000-0002-5634-6225，主要从事生物固氮与菌植互作研究工作，E-mail：dupuxuan ************
1期·103·
0引言
【研究意义】氮素是植物正常生长发育不可或缺的关键生命元素（杨正等，2021）。自然界中的氮绝大部分以单质分子氮气（N
2
）存在于大气中，不能被植物直接吸收利用（储成才等，2021）。目前，中国主要依靠化学氮肥实现农作物增产，但生产氮肥要消耗大量能源，会提高农业生产成本，加重大气污染。长期过量施用化肥，不仅导致土壤板结并引起土壤性质变化，还有导致地下水和土壤污染的风险（Olivares et al.，2013；Rana et al.，2020）。花生（Ara-chis hypogaea L.）是世界主要的油料作物之一，也是蛋白质和油脂的重要来源（Shao et al.，2020）。与其他豆科植物一样，花生能与土壤中的根瘤菌共生结瘤固氮。花生生长过程中所需的氮约有55%来自共生固氮，每年每公顷花生固定的氮高达100~190kg，因此花生种植只需较少的含氮肥料，且在作物轮作中具有土壤改良效果（Wang et al.，2021）。相比工业固氮，生物固氮不仅固氮量巨大，而且经济有效、无污染，是农业生产节本增效的有效手段（谢祖彬等，2020）。工业固氮每年固定近1亿t氮，而全球生物固氮量约1.75亿t，其中根瘤菌—豆科植物共生系统的固氮量约占全球生物固氮总量的一半（Nguyen et al.，2020）。因此，优良花生根瘤菌的分离筛选及田间应用对减施化学氮肥和保障农业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】根瘤菌作为豆科作物和牧草中安全有效的接种剂之一，为提高豆科植物的产量和品质提供了有效途径（Silva et al.，2017）。因此，巴西、美国和阿根廷等国家已将各种根瘤菌剂广泛应用于农业以提高豆科作物产量（Ulzen et al.，
2016）。而中国关于根瘤菌剂应用于豆类种植的研究相对较少。吴海龙等（2016）从山东省5个采样点分离到106株花生根瘤菌，基于recA序列分析选定7株代表菌株，通过温室盆栽试验筛选出1株共生固氮能力最强的代表菌株YIC61059。刘瑞瑞等（2016）从河北省保定市采集的花生根瘤样品中分离出19株花生根瘤菌，接种花生品种天府3号后，发现菌株Hbu074005可显著提高植株的干质量、根瘤数量、株
高和果穗数。刘鹏等（2019）从福建省4个采样点分离鉴定了10株花生根瘤菌，回接花生品种闽花8号筛选出4株固氮效率较高的根瘤菌后进行田间试验，发现高效菌株能显著促进酸性土壤中花生的生长。张俊杰等（2021）从河南省正阳县分离出67株花生根瘤菌，系统发育分析表明所有菌株属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），选取的11个代表菌株均能显著提高花生叶绿素含量、地上部分和地下部分干重、株高和根长。Shang等（2021）使用3株高效共生固氮的花生根瘤菌作为接种剂，发现接菌处理不仅在花生不同发育阶段显著促进了植株生长，还增加了潜在植物根际促生菌的相对丰度。总体而言，我国对根瘤菌资源的开发利用极其有限，只有少部分根瘤菌用于制造菌剂并推广应用于农业生产。【本研究切入点】2015年农业农村部印发的《到2020年化肥使用量零增长行动方案》中提出，在有条件的地区引导农民施用根瘤菌剂，促进花生、大豆和苜蓿等豆科作物固氮肥田。目前已有研究对广东省花生根瘤菌的遗传多样性和地理分布进行了分析（Chen et al.，2016），但优良菌株的筛选及应用还未见报道。【拟解决的关键问题】从广东省3个地级市采集的土样中分离土著花生根瘤菌，通过回接试验检测其共生固氮性能，将固氮效果好的菌株与不同花生品种进行匹配试验，结合土壤盆栽和田间试验评价其促生效果，以期为花生根瘤菌的田间推广应用提供理论依据和候选菌种。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1土样及花生品种供试土样于2019年10月下旬采集自广东省广州市白云区（水旱轮作）、湛江市遂溪县金龟岭（旱旱轮作）和清远市佛冈县汤塘镇（水旱轮作）。捕获土著根瘤菌及回接试验所用花生品种为粤油43，匹配试验所用花生品种为昌黎大花生、顶仁仔、吴川种、粤油901、粤油1821和粤油420，土培和田间试验所用花生品种为粤油901，由广东省农业科学院作物研究所提供。
1.1.2培养基YMA培养基：甘露醇10g，酵母粉
GDHS-14and CK.【Conclusion】Peanut rhizobia GDHS-5and GDHS-14boast excellent symbiotic nitrogen fixation. GDHS-5can efficiently fix nitrogen and has broad-spectrum nodulation and can significantly increase pod number per plant and yield of peanuts under field conditions，so it has great potential for application in field.
Key words：peanut；rhizobia；symbiotic nitrogen fixation；isolation and screening刘瑞瑞
Foundation items：Guangdong Key Research and Development Project（2022B020*******）；Guangdong Science and Technology Planning Project（2021A0505030047）；Guangdong Modern A
gricultural Industrial Technology System Project（2022KJ136-02）
杜普旋等：花生根瘤菌的分离筛选及应用
54卷
南方农业学报·104·
0.4g ，K 2HPO 40.5g ，MgSO 4·7H 2O 0.2g ，NaCl 0.1g ，CaCl 2·2H 2O 0.064g ，Rh 微量元素液（H 3BO 35g ，Na 2MoO 45g ，加蒸馏水至1000mL ，下同）4mL ，加蒸馏水至1000mL ，pH 6.8~7.0。
BSE 培养基：甘露醇10g ，K 2HPO 40.5g ，MgSO 4·7H 2O 0.2g ，NaCl 0.1g ，CaCl 2·2H 2O 0.064g ，Rh 微量元素液4mL ，豆芽汁（500g 豆芽+1.5L 蒸馏水煮沸30min 后用纱布过滤2次）800mL ，加蒸馏水至1000mL ，pH 6.8~7.0。
Fahraeus 无氮植物营养液：CaCl 2·2H 2O 0.1g ，MgSO 4·7H 2O 0.12g ，KH 2PO 40.1g ，Na 2HPO 4·12H 2O 0.15g ，柠檬酸铁5mg ，Gibson 微量元液（H 3BO 32.86g ，MnSO 4·4H 2O 2.03g ，ZnSO 4·7H 2O 0.22g ，Na 2MoO 4·2H 2O 0.13g ，CuSO 4·5H 2O 0.08g ，加蒸馏水至1000mL ）1mL ，加蒸馏水至1000mL 。1.2试验方法
1.2.1根瘤菌的分离纯化将粤油43种子浸入75%乙醇表面消毒8min ，无菌水冲洗8~10次，播种于采集的土样中以捕获土著花生根瘤菌。35d 后从花生根部选取个大、饱满的根瘤，用NaClO 表面消毒2min ，无菌水冲洗10次。在无菌条件下，用镊子将根瘤夹碎，挤出汁液涂布在含结晶紫的YMA 固体培养基上，28℃培养4~7d 。长出单菌落后采用划线分离法多次转至新的YMA 固体培养基上获得单菌落。观察菌落形态、大小、透明度、粘稠度、颜等，结合细菌染和显微镜观察，直至纯化为止。
1.2.2根瘤菌的分子鉴定以分离菌株的单菌落作为模板，使用细菌通用引物16S-27F （5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'）和16S-1492R （5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rDNA 序列进行测序，将测序结果提交NCBI 进行BLAST 分析，使用MEGA-X 进行序列比对，以Neighbor-Joining 法对其构建系统发育进化树，Bootstrap Replications 设为1000。
1.2.3盆栽试验挑选大小均匀的花生种子，浸入75%乙醇表面消毒8min ，无菌水冲洗8~10次，无菌水浸泡40min 。回接试验与匹配试验所用花生种子均播种于灭菌蛭石中，浇灌Fahraeus 无氮植物营养液。土壤盆栽所用花生种子不需表面消毒，直接播种于装有田间土壤（取自广东省农业科学院白云试验基地）的花盆中，浇灌自来水。将根瘤菌接种于YMA 液体培养基，28℃摇床培养2~4d ，用无菌水将菌液的OD 600值统一调为0.2。待花生发芽长出第1片真叶时，向每颗花生幼苗根部接种1mL 菌液，每株菌设5个生物学重复，以不接菌为对照（CK ）。接
菌28d 后收获，统计花生地上部分高度、地上部分鲜重、根瘤数量、根瘤鲜重，采用乙炔还原法测定根瘤固氮酶活性。1.2.4
田间试验
选取优良菌株在BSE 培养基中
摇瓶发酵培养，在广东省农业科学院白云试验基地进行田间接菌试验，以不接菌为对照（CK ）。随机区
组设计，3个生物学重复。每小区面积为27.0m 2
（长
18.0m 、宽1.5m ），行间距20cm 、株间距25cm 。种植花生品种为粤油901。杂草、病虫害防控按花生田间日常管理执行。在花生饱果成熟期取样，每小区随机取5株测定地上部分鲜重、根瘤数量、根瘤鲜重和单株荚果数。收获后进行小区测产，使用瑞典波通DA7250近红外分析仪测定花生籽粒中的花生蔗糖、粗脂肪、粗蛋白和总氨基酸等品质性状。1.3
统计分析
采用Excel 2019对表型数据进行统计和整理，SPSS 25.0进行显著性差异检验，GraphPad Prism 8.0.2作图。
2结果与分析
2.1
土著花生根瘤菌的分离鉴定
从粤油43的根瘤中分离纯化出15株花生根瘤菌，分别命名为GDHS-1~GDHS-15。将15株花生根瘤菌的16S rDNA 测序结果进行BLAST 分析，选择11个参比菌株进行序列比对，构建系统发育进化树（图1）。结果表明，进化树具有2个分枝，分别为Branch Ⅰ（Bradyrhizobium ）和Branch Ⅱ［根瘤菌属（Rhizobium ）］，所分离出的15株根瘤菌均属于Branch Ⅰ。2.2
回接试验的共生固氮表型
以不接菌为CK ，将15株花生根瘤菌分别回接粤油43。接菌28d 后收获，统计共生固氮表型数据。由表1结果可知，供试菌株均能与粤油43共生结瘤，与CK 相比，接菌处理提高了花生地上部分鲜重、根瘤数量、根瘤鲜重和固氮酶活性。所有接菌处理的平均地上部分鲜重为8.91g ，平均根瘤数量为149.81个，平均根瘤鲜重为0.25g ，平均固氮酶活性为1.92μmol/（g ·h ）。各菌株的共生表型变异幅度较大，其中
固氮酶活性的变异系数最大（69.42%），地上部分鲜重的变异系数最小（25.34%）。接种GDHS-5的地上部分鲜重和固氮酶活性最高，接种GDHS-14的根瘤数量和根瘤鲜重最高。将共生表型数值从大到小排列，选出各共生表型中排在前5位的菌株。结果发现，GDHS-5与GDHS-14的4个共生表型数值均排在前5位，说明这2株根瘤菌的共生固氮能力较好，可作为优良花生根瘤菌候选菌株。
1期
·105·
处理
Treatment
CK
GDHS-1GDHS-2GDHS-3GDHS-4GDHS-5GDHS-6GDHS-7GDHS-8GDHS-9GDHS-10GDHS-11GDHS-12GDHS-13GDHS-14GDHS-15平均值Mean
标准差Standard deviation 变异系数（%）Variation coefficient
地上部分鲜重（g/株）
Above-ground part fresh
weight （g/plant ）5.09±1.01d 10.69±1.32abc 6.73±1.41cd 8.42±0.74abcd 6.89±1.95cd 13.05±3.57a 9.11±2.53abcd 10.25±2.23abc 9.36±2.05abcd 7.82±1.03cd 8.29±1.45bcd 5.53±0.78d 7.34±1.66cd 6.48±0.97cd 12.59±4.52ab 11.17±2.18abc
8.912.2625.34
根瘤数量（个/株）Root nodule number （nodule/plant ）
0g
155.50±9.27bcd 135.60±18.93bcdef 172.90±56.18ab 146.70±32.59bcde 195.30±35.81ab 85.40±25.37ef 107.80±11.54cdef 133.70±29.17bcdef 189.30±28.14ab 167.30±33.13abc 81.30±16.39f 102.80±13.61def 188.36±24.28ab 228.00±37.62a 157.20±20.15bcd
149.8142.6328.46
根瘤鲜重（g ）Root nodule fresh weight
0h
0.18±0.05defg 0.25±0.06cdef 0.26±0.08cdef 0.21±0.04cdefg 0.43±0.06ab 0.17±0.04defg 0.16±0.03efg 0.31±0.06bc 0.32±0.07bc 0.28±0.06cde 0.14±0.05fg 0.12±0.06gh 0.19±0.05cdefg 0.51±0.08a 0.29±0.06cd
0.250.1142.55
固氮酶活性［μmol/（g ·h ）］Nitrogenase activity
0g 2.32±0.59cd 1.52±0.44cdef 1.34±0.28cdef 0.87±0.22fg 5.03±1.34a 1.20±0.26def 2.37±0.19c 3.59±0.78b 0.08±0.01g 0.67±0.48fg 1.54±0.18cdef 1.06±0.28efg 1.31±0.22cdef 3.87±0.49b 2.09±0.13cde
1.921.3469.42
表115株根瘤菌回接粤油43的共生固氮表型
Table 1Symbiotic nitrogen fixation phenotypes of 15rhizobia reinoculated withYueyou 43
图1基于花生根瘤菌16S rDNA 构建的系统发育进化树Fig.1Phylogenetic tree based on 16S rDNA of peanut rhizobia
15个分离菌株为黑加粗字体，其余为参比菌株
The 15isolated rhizobia strains were noted with black bold font ，and the rest were reference strains
同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P <0.05）
Different lowercase letters in the same column indicated significant difference between treatments （P <0.05）
Bradyrhizobium liaoningense strain 2281Bradyrhizobium liaoningense strain NBRC 100396GDHS-8GDIIS-7GDHS-1
Bradyrhizobium ottawaense strain OO99GDHS-15GDHS-11
Bradyrhizobium japonicum strain LMG 6138Bradyrhizobium yuanmingense strain NBRC 100594GDHS-5
Bradyrhizobium diazoefficiens strain USDAl10
Bradyrhizobium cytisi strain CTAW11GDHS-14GDHS-12GDHS-9GDHS-6
GDHS-2GDHS-3GDHS-4GDHS-10GDHS-13
Bradyrhizobium arachidis strain CCBAU 051107
Rhizobium tropici CIAT 899
Rhizobium cauense strain CCBAU 101002
Rhizobium endophyticum CCGE 2052
Branch Ⅰ
Branch Ⅱ73
646499
6698
0.010
杜普旋等：花生根瘤菌的分离筛选及应用
54卷
南方农业学报·106·2.3
优良菌株与不同花生品种的匹配试验
以不接菌为CK ，将GDHS-5与GDHS-14分别接种昌黎大花生、顶仁仔和吴川种等6个花生品种。由图2结果可看出，与CK 相比，接菌处理均不同程度地提高了花生地上部分高度和鲜重，且供试菌株能与6个花生品种有效共生结瘤，说明其具有广谱结瘤性。从花生品种来看，接种GDHS-5与GDHS-14后6个花生品种的地上部分高度和鲜重的平均增幅分别为4.40%~24.60%和6.04%~90.26%。其中粤油901的增幅最大，接种GDHS-5与GDHS-14后地上部分高度分别增加24.22%和24.97%，地上部分鲜重分别增加104.95%和75.58%，表明粤油901与供试菌株的匹配性最好（图2-A 和图2-B ）。此外，由图2-C 和图2-D 可看出，3个地方品种（昌黎大花生、顶仁仔和吴川种）的平均结瘤数量和根瘤鲜重低于3个选育品种（粤油901、粤油1821和粤油420）。从菌株来看，供试花生品种接种GDHS-5后地上部分高度和鲜重的增幅及根瘤数量和根瘤鲜重均高于GDHS-14的接种效果，表明GDHS-5的共生结瘤能力优于GDHS-14。2.4土壤盆栽试验结果
将GDHS-5和GDHS-14于土壤盆栽中分别接种粤油901，以不接菌为CK 。由图3-A 可看出，与CK 相比，接种GDHS-5或GDHS-14的植株较高，茎较粗壮，根系较发达。表型数据统计结果表明，接种GDH
S-5后花生地上部分高度、地上部分鲜重、根瘤数量和根瘤鲜重分别增加14.58%、22.51%、37.25%和32.89%，除地上部分鲜重外均与CK 存在显著差异（P <0.05，下同）。接种GDHS-14后分别增加8.64%、5.23%、25.63%和10.49%，只有根瘤数量与CK 存在显著差异。综上可知，在土壤环境中接种GDHS-5或GDHS-14均可提高粤油901的结瘤数量和根瘤鲜重，促进植株生长。GDHS-5较GDHS-14有更好的促生作用，与匹配性试验结果一致。2.5田间试验结果
将GDHS-5和GDHS-14在田间接种粤油901，以不接菌为CK ，于饱果成熟期测定共生结瘤表型、产量和品质性状。表2统计结果表明，除粗脂肪含量外，接种GDHS-5后花生地上部分鲜重、根瘤数量、根瘤鲜重、单株荚果数、产量及花生蔗糖、粗蛋白和总氨基酸含量分别增加19.07%、22.01%、19.76%、35.82%、
图2优良根瘤菌接种6个花生品种的共生固氮表型
Fig.2Symbiotic nitrogen fixation phenotypes of 6peanut varieties inoculated with excellent rhizobia
同一品种不同小写字母表示处理间差异显著（P <0.05）
Different lowercase letters indicated significant difference among treatments for the same variety （P <0.05）
地上部分鲜重（g /株）A b o v e -g r o u n d p a r t f r e s h w e i g h t （g /p l a n t ）
地上部分高度（c m /株）A b o v e -g r o u n d p a r t h e i g h t （c m /p l a n t ）
25.0020.0015.0010.005.000.00
昌黎大花生
顶仁仔
吴川种
粤油901
粤油1821
粤油420
昌黎大花生
顶仁仔
吴川种
粤油901
粤油1821
粤油420
10.008.006.004.002.000.00
昌黎大花生
顶仁仔
吴川种
粤油901
粤油1821
粤油420
昌黎大花生
顶仁仔
吴川种
粤油901
粤油1821
粤油42
根瘤数量（个/株）R o o t n o d u l e n u m b e r （n o d u l e /p l a n t ）
根瘤鲜重（g /株）R o o t n o d u l e f r e s h w e i g h t （g /p l a n t ）
350.00
280.00210.00140.0070.000.00
0.500.400.300.200.100.00
b a b b
a b
a
a a
b a b
b
a b
c ab
a a
a a
b
a b b
a
b
a b
c a a
c c c c b a
a b
a b
b
a
b a b
c a
a
c c
c b a
a a A
B
C
D 花生品种Peanut variety 花生品种Peanut variety 花生品种Peanut variety 花生品种Peanut variety
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