黄据芹;佟丽丽;王怀友
【摘 要】陈静门事件利用荧光光谱研究了脱落酸(Abscisic acid)与伊文思蓝(Evans blue)的相互作用.用266 nm激发光激发时,伊文思蓝的最大发射波长为396 nm.伊文思蓝与脱落酸相互作用,使伊文思蓝发生荧光猝灭,根据Stern-Volmer方程研究了荧光猝灭的类型及机理,实验证明脱落酸与伊文思蓝发生的静态猝灭,即脱落酸和伊文思蓝形成了一种稳定的复合物.伊文思蓝的相对荧光强度与脱落酸的浓度线性相关,线性方程为F0/F=0.781 53+3.9153×104c,线性相关系数为0.9976.通过实验求算了脱落酸与伊文思蓝的结合点常数KABA-EB=1.838×105L/mol和结合点数n=1.171,由此建立了测定植物中脱落酸的新方法.
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2010(019)006
【总页数】建筑学就业4页(P17-20)
【关键词】伊文思蓝;脱落酸;荧光猝灭
【作 者】黄据芹;佟丽丽;王怀友
【作者单位】山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南,250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南,250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南,250014
【正文语种】中 文
植物的内源激素控制着植物正常的生理过程,如种子的萌发、植株的生长和衰老、一些器官的脱落等。植物激素主要分为4大类：生长素、赤霉素、细胞分裂素和抑制激素[1]。脱落酸(ABA,又称Abscission II)是一种非常重要的植物抑制激素，它主要的生理功能是通过控制气孔的关闭，阻碍赤霉素和细胞分裂素对植物的促生长作用，加速植物器官的脱落。一般来说，干旱、寒冷、高温、盐渍和水涝等逆境都能使植物体内ABA迅速增加，同时抗逆性增强。但由于植物内源激素通常是痕量的，且干扰物质较多，因此在对其进行定量定性分析时遇到了很大的困难。目前对于脱落酸的测定主要有高效液相谱法(HPLC)[2-5]、气相谱-质谱联用法(GC-MS)[6,7]、免疫学方法[8]和毛细管电泳法(CZE)[9] 等。这些方法或多或少存在一些不足之处，如从植物中提取植物激素的方法主要有湿法萃取、固相萃取和气相萃取法等。这些方法需要复杂的分离纯化步骤和较昂贵的仪器设备，步骤繁琐且对周围
的环境和人体健康不利。而免疫学方法抗体的制备较复杂，实验成本高。近年来，液相谱-电喷雾离子化-质谱联用技术(LC-ESI-MS/MS)[10,11]被应用在植物中脱落酸的测定，它虽然避免了从植物中提取植物激素的复杂过程，但高效液相谱需要用到大量的有机溶剂，且费时。荧光光谱法因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的优点而受到人们的广泛关注。为了提高分析方法的灵敏度、准确性和选择性，笔者利用荧光光谱法对样品中的ABA进行了分析测定。ABA本身没有荧光，Liuxin等人利用激光诱导荧光法检测ABA与8-氨基-1,3,6-三磺酸酯反应生成的荧光衍生物来实现植物中ABA的检测[12]。笔者利用ABA对伊文思蓝的猝灭作用，根据荧光猝灭原则建立了测定ABA的新方法。
伊文思蓝是一种常用的生物化学染剂，被广泛地应用于从定量和形态上研究动物血管的蛋白质渗漏，用于由于高血压引起的大脑软组织血管中蛋白质溢出物[13，14]的测定。伊文思蓝还具有优于其它荧光探针物质的性质，大多数的染剂对人体有可观测的毒性，而伊文思蓝是没有毒性的生物染剂，伊文思蓝的结构式见图1。
图1 伊文思蓝的结构
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
荧光分光光度计：LS-55型，英国Perkin-Elmer公司；
荧光分光光度计：FLS920型，基于显微的稳态、瞬态荧光检测仪，英国Edinburgh公司；
超纯水系统：Direct-Q3型，美国Millipore公司；
酸度计：pHS-3C型，上海雷磁仪器厂；
伊文思蓝：分析纯；
脱落酸：分析纯，美国Alfa公司；
脱落酸标准储备液：1.00×10-4 mol/L，准确称取0.001 3 g脱落酸标准品用无水乙醇溶解，用水稀释定容至50 mL，4℃下避光保存，用时逐级稀释至所需浓度；
伊文思蓝(Fluka 46160)标准储备液：1.00×10-3mol/L，准确称取0.096 1 g伊文思蓝标准品，
用水溶解定容至100 mL，4℃下避光保存，用时逐级稀释至所需浓度；
缓冲溶液：pH 7.17，浓度1/15 mol/L NaH2PO4和1/15 mol/L Na2HPO4按体积比3∶7混和均匀；
实验所用其它试剂为分析纯，实验用水均为超纯水(电阻率不小于18.2 MΩ·cm)。
1.2 实验步骤
准确移取2.0 mL 1.00×10-5 mol/L的伊文思蓝溶液和不同体积的1.0×10-4 mol/L脱落酸溶液于10 mL比管中，用水稀释至刻度，摇匀，室温下放置10 min。λex/λem=266/397 nm，扫描速度240 nm/min，狭缝宽度皆为10 nm，绘制荧光光谱图。
2 结果与讨论
2.1 脱落酸对伊文思蓝荧光光谱的影响
按照实验步骤，分别绘制伊文思蓝及加入脱落酸后的荧光发射光谱，结果见图2。当用266 nm激发时，伊文思蓝的最大发射波长位于397 nm；随着加入脱落酸的浓度逐渐增大，伊
文思蓝的相对荧光强度逐渐降低，这表明加入脱落酸后，伊文思蓝发生了有规律的猝灭。
伊文思蓝的浓度为2.000×10-6mol/L，1→8脱落酸的浓度分别为0、2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5、1.2×10-5、1.4×10-5mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液pH 7.17图2 不同浓度的脱落酸对伊文思蓝荧光发射光谱的影响
长城的传说故事2.2 酸度的影响
分别试验了pH值对脱落酸-伊文思蓝体系的相对荧光强度的影响，结果见图3。由图3可见，脱落酸-伊文思蓝体系在pH 3～6时相对荧光强度逐渐增大，pH 7时荧光强度最大，在pH 8～12之间时相对荧光强度几乎不变。为了在生理条件下测定脱落酸与伊文思蓝的反应，选择pH 7.17的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液用来控制体系的酸度。
图3 酸度对伊文思蓝荧光强度的影响
2.3 时间对猝灭体系的影响
分别试验了时间对脱落酸-伊文思蓝体系相对荧光强度的影响，结果见图4。由图4可知，在
室温下伊文思蓝的相对荧光强度随放置时间的增加而降低，但放置时间太短，体系反应不完全。因此，选择放置15 min后进行荧光光谱绘制和相对荧光强度的测量。
图4 放置时间对伊文思蓝荧光强度的影响
2.4 荧光猝灭机理探讨
实验表明，脱落酸对伊文思蓝的荧光有猝灭作用。猝灭机理分为静态、动态猝灭和静态动态混合猝灭；静态和动态猝灭Stern-Volmer曲线的特征都是直线，混合猝灭Stern-Volmer曲线的特征是向上弯曲的非线性关系[15]。为了确定荧光猝灭机理的类型，进行了荧光猝灭实验。按照实验步骤，测定F0及F的值(F、F0 分别为脱落酸存在和不存在下伊文思蓝的相对荧光强度)，可得到Stern-Volmer图如图5所示。显然，Stern-Volmer图为线性，线性回归方程为：F0 /F=0.781 53+3.915 3×104c,相关系数r=0.997 6。
图5 脱落酸猝灭伊文思蓝的Stern-Volmer曲线
张恒郑爽男友区分静态猝灭和动态猝灭最确切的方法是荧光寿命的测量。在静态猝灭情况下，猝灭剂的存在并没有改变荧光分子激发态的寿命，即τ0/τ1=1；而在动态猝灭情况下，猝灭剂的存在
使荧光寿命缩短，即τ0/τ1=F0/F[16]。因此，为了更准确地判断脱落酸对伊文思蓝的猝灭类型，测得了伊文思蓝的荧光寿命和伊文思蓝与脱落酸反应物的荧光寿命及它们的荧光强度，结果见图6和图7，图中τ0=5.97 ns，τ1=6.04 ns，即τ0/τ1≈1，因此脱落酸对伊文思蓝的荧光猝灭是静态猝灭。
图6 伊文思蓝的荧光寿命
图7 在脱落酸存在下伊文思蓝的荧光寿命
对静态猝灭反应来说，如果假定在生物分子中有相似的且不相关的结合点，那么荧光强度和猝灭介质之间可按式(1)反应：
nQ+B→Qn+B
(1)
B是有荧光的生物分子，Q是具有猝灭作用的药物分子，Qn+ B是猝灭的生物分子，其生成常数见式(2)：
包贝尔拍婚纱照Ka=[Qn+B]/([Q]n[B])
(2)
如果生物分子的总浓度(包括游离的和与猝灭分子反应的)是[B0]，则[B0]=[Qn+B]+[B]，[B]是未反应的生物分子的浓度，那么荧光强度与未反应的生物分子的浓度之间的关系是[B]/[B0]=F/F0，则有：
lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]
(3)
K是伊文思蓝与脱落酸的结合常数，可通过lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图，结果见图8。斜率为n,截距为lgK，由此可得伊文思蓝与脱落酸的结合常数K=1.838×105 L/mol，结合点数n=1.171，相关系数r=0.997 6。
脱落酸的浓度为1.000×10-4mol/L； 伊文思蓝的浓度为2.000×10-6mol/L图8 lg[(F0-F)/F]与lg[ABA]关系图
2.5 共存离子影响
试验了不同离子对测定脱落酸的影响。以500 μg/mL为起始浓度，如果干扰存在，逐渐降低浓度直至干扰降至最低。下列倍数的共存物质不干扰测定：K+、Na+、Cl-、H2PO4-、NO3-(300)，Mg2-(150)，CO32-(100)，SO42-(225)，腺嘌呤(0.1)。因此方法具有良好的选择性。
3 结语
利用脱落酸对伊文思蓝的荧光具有猝灭作用研究了测定脱落酸的新方法。实验结果表明：脱落酸与伊文思蓝发生荧光猝灭反应的结合常数KABA-EB=1.838×105L/mol，结合点数n=1.171。
参 考 文 献
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