闫现伟1马雷钧1诸珏珉1程鹏飞1张芹2王子慧1姚健1许博1郁佳俊1
1上海生物制品研究所有限责任公司质量检定室201403; 2上海生物制品研究所有限责任
公司疫苗二室201403
通信作者：郁佳俊，Email:yujiajunl982@hotmail
【摘要】目的制备麻疹病毒抗血清，用于含麻疹病毒成分的联合减毒活疫苗的检定。方法制
备麻疹病毒Edm-3株病毒收获液，加人弗氏佐剂，对家兔和豚鼠分别经皮下多点或腹腔途径免疫3针，
测。结果用4种免疫方式制备的抗血清中和效价均高于1:320，其中豚鼠背部皮下组中和效价为最
高，达到1:2 459；将豚鼠背部皮下组抗血清稀释至1:320，能够完全中和每毫升2 ()0()半数细胞培养
物感染量的麻疹病毒，同时对V ero细胞、R K-13细胞、M RC-5细胞无细胞毒性，且不可中和腮腺炎病
毒、风疹病毒和水痘病毒。结论采用Edm-3株麻疹病毒收获液，通过背部皮下多点方式免疫豚鼠可
制备具有较高中和效价的麻疹抗血清，可用于疫苗检定。
【关键词】麻疹病毒；免疫血清；佐剂；中和试验
【中图分类号】R392.7 DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200819-00082
Preparation of measles virus antiserum for vaccine test
Yan Xianuuei1, Ma L eiju n', Zhu Juemin 1, Cheng P e n g fe i1, Zhang Qin2 , Wang Z ih u i1, Yao Jian ',
Xu B o\Yu J ia ju n1
1 Department o f Quality Control，Shanghai Institute o f Biological Products Co.，L td.，Shanghai
201403，China; 2Vaccine Division J}，Shanghai Im titute o f Biological Products Co.，L td.，Shanghai
201403 , China
Corresponding author ：Yu J ia ju n, E m ail：yujiajun1982@hotmail. com
【Abstract】Objective To prepare antiserum against measles virus for tests of combined vaccines
containing measles virus. Methods The Edm-3 strain measles virus harvest was prepared as antigen.
Rabbits and guinea pigs were immunized with 3 doses of the antigen and Freund’s adjuvant through
multiple-point subcutaneous or intraperitoneal routes respectively. The serum was collected to prepare
antiserum. The antiserum was filtered and inactivated, and its neutralization titer, neutralization ability,
cytotoxicity, and specificity were tested. Results The neutralization titers of antiserum prepared by 4
immune processes were all higher than 1：320,and the titer of subcutaneous group of guinea pig was the
张瑞希整容失败
highest (1 ：2 459). The antiserum of subcutaneous group of guinea pigs could completely neutralize
2 000 50%cell culture infectious dose per ml of measles virus when diluted to 1：320. The antiserum
had no cytotoxicity to Vero cells, RK-13 cells, and MRC-5 cells. The antiserum could not neutralize
mumps virus, rubella virus, and varicella virus. Conclusion High neutralization titer antiserum against
measles virus can be prepared by subcutaneous immunization of guinea pigs with Edm-3 strain measles
补水效果好的眼霜virus, which can be used for vaccine test.
【Key words】Measles virus; Immune sera；Adjuvant；Neutralization tests
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200819-00082
麻疹病毒抗血清主要用于麻疼-腮腺炎-风疹系 列减毒活疫苗病毒鉴别、滴度以及外源因子等项目的检定[12]。目前无合适的麻疹病毒抗血清在售，现 用的抗血清余量不足。作为关键检测试剂，制备足
量的具有较高中和效价的麻瘆病毒抗血清以满足大 量疫苗样品持续性检定工作的开展非常重要。本研 究采用新鲜制备的麻疹病毒收获液辅以弗氏佐剂，以不同的免疫途径接种家兔和豚鼠获取抗血清，以确定能满足检定需求的麻疹抗血清制备方法。
1材料与方法
1.1毒株和标准品
麻疹病毒Edm-3株、麻疼减毒活疫苗国家标准 品来自中国食品药品检定研究院；麻疹、腮腺炎、风 疹和水痘4种减毒活疫苗效价滴定的工作品均来自 上海生物制品研究所有限责任公司（上海公司)生产 部；麻疹抗血清参考品来自上海公司研发部。
1.2细胞和培养基
V ero细胞、RK-13细胞、MRC-5细胞均由上海 公司质量检定室提供；M E M培养基购自美国GIBCO公司，小牛血清购自上海慧人生物科技工程 研究所，谷氨酰胺购自日本和光纯药工业株氏会社。
1.3主要试剂和仪器
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自美国Sigma公司；生物安全柜、低温离心机均购自美国赛 默飞世尔公司，CO：培养箱购自美国Nuaire公司。
1.4实验动物
新西兰系家兔，普通级，体重2 k g左右，雄性；荷兰系豚鼠，清洁级，体重350 g左右，雄性，均来源 于上海公司动物中心。动物生产许可证号为：SCXK(沪)2(>15-()()()3；动物使用许可证号为:SYXK (沪)2015-0()14。
1.5抗原制备
V ero细胞进行传代培养，待细胞长至单层，接 种麻疹病毒，33 °C,5%C02培养，细胞病变液于 4 °C、979 X g离心30 min，取上清液收获病毒〜
并对病毒进行常规细胞中和法鉴别及基因测序、滴 度测定等试验。经离心纯化的病毒收获液与弗氏佐 剂等体积混合作为免疫原，在振荡混勻仪上连续高 速振荡混匀>2 min，使免疫原快速乳化M。
1.6抗血清制备
采用背部皮下多点法和腹腔注射法[6]接种家兔 和豚鼠，共设4组，每组30只，间隔2周接种3剂。每只家兔每次接种2 ml，每只豚鼠每次接种().5 ml。末次免疫1()〜12 d后采血。血液移至离心管,4 °C 条件下，1 74〇Xg*离心1〇 min，取上清液，〇. 22 jum 除菌过滤。56 °C水浴3() min进行补体灭活。制备 的血清分装到小管中，冻存于-60 °C以下。
1.7抗血清检定
1.7.1中和效价测定采用固定病毒、稀释血清中 和法。取麻疹减毒活疫苗国家参考品，按照标示效 价稀释至每毫升2 ()(>(>半数细胞培养物感染量(50% cell culture infectious dose，CCID5ii).，然后将 抗血清倍比稀释至1 : 4096。用V ero细胞铺96孔 细胞板，将稀释好的抗血清与病毒液等量混合，37 °C中和1h后加入96孔板，每个血清稀释度加 川孔。同时设细胞对照(Vero细胞)、病毒对照(Vero 细胞+ 2 0()(>COD^/m l病毒）、参考抗血清对照(V ero细胞+ 2 (>()0CCID5,,/m l病毒+已标定的麻 疹抗血清），孵育7〜8 d。用Karber法计算抗血清中 和效价。以保护50%细胞孔不出现细胞病变的抗血 清稀释度定义为抗血清的中和效价。重复3次。
1.7.2中和能力测定采用固定病毒、稀释血清中 和法对中和效价较高的抗血清进行中和能力测定，方法同1.7. 1。设病毒对照，结果应为2 000 CCIlWml 左右，同时设细胞对照和参考抗血清对照，应为阴 性。孵育8〜l(>d。细胞孔完全不出现细胞病变的 抗血清稀释度定义为该稀释度抗血清具有中和2 ()00 CCID5…/ml麻疹病毒的能力。
1.7.3细胞毒性分析选择中和效价较高的一组抗血清进行细胞毒性分析。在V ero细胞、RK-13 细胞、MRC-5细胞上每孔加人().6 m l抗血清（已稀 释至使用效价），按照各种细胞相应的培养条件培 养，显微镜下观察抗血清对细胞的正常生长有无干 扰或毒性影响。同时设阴性对照(不加抗血清)。1.7.4特
异性干扰分析选择中和效价较高的一组抗血清进行特异性分析。在V ero细胞上接种麻 瘆病毒、腮腺炎病毒，在RK-13细胞上接种风疹病 毒，在MRC-5细胞上接种水痘病毒。均同时设两 组，一组加足量麻疹抗血清，另一组加空白培养基，培养后测定病毒滴度，比较两者结果差异。
2结果
2.1病毒鉴别及测序
制备的病毒收获液经常规细胞中和法鉴别，能 被参考麻疹病毒抗血清完全中和，空白对照组病毒 量在50(>CC1D5,，以上。经二代基因测序，病毒基因 与上海公司生产用麻疹病毒(沪191株)全基因序列 比较相似度为99. 75%，可确定为麻瘆病毒，且与生 产株不同。
2.2免疫前病毒滴度测定
经细胞中和法测定，制备得到的病毒收获液在
3次免疫前的病毒滴度测定结果分别为6. U 、5. 8、5. 7 lgCCHW m l 。2.3血清中和效价标定
4个组别制备得到抗血清中和效价高低依次为 豚鼠背部皮下组> 豚鼠腹腔组 > 家兔背部皮下组>家 兔腹腔组，见表1。细胞对照组细胞为致密单层，生 长状态良好；病毒对照组细胞病变明显，病毒量测算
为 1 585 CCID 5()/ml 。
表1
不同免疫途径所得抗血清中和效价
组别第一次第二次第三次均值豚鼠背部皮下组1 ： 2 3441 ： 2 6311 : 2 4551 ： 2 459豚鼠腹腔组丨：1 0241 ： 1 8621 : 1 9951 ： 1 790家兔背部皮下组1 ： 1 ()()()1 ： 9331 ： 8711 ： 935家兔腹腔组1 ： 6171 ： 6611 ： 7591 : 679参考抗血清a
I ： 1 514
1 ： 1 318
1 : 933
1 : 1 255
注：3标示效价1:1122
2. 4血清中和能力测定
将制备的麻疹病毒抗血清稀释到1 : 320时，
能完全中和2 ()0() CCID 5l ,/m l 的麻瘆病毒。2.5血清细胞毒性分析
与对照组相比，各组细胞状态未发现明显差异，
证明该批次麻疹病毒抗血清对V e ro 细胞、RK -13 细胞、MRC -5细胞无细胞毒性，见图1。2.6血清特异性干扰分析
麻疹病毒抗血清对麻疹病毒有中和作用，对风
疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒无中和作用，血清组 和对照组病毒效价未见明显差异（差值小于
0. 2 lgC aD 5l ,/ml ，考虑为细胞状态、人为操作等可 能造成的检测误差），表明制备的麻疹病毒抗血清有 较高特异性，见表2。
表2
麻疹病毒抗血清对不同参考品病毒效价的影响(l g 半数细胞培养物感染量/m l)
病毒标示效价细胞基质抗血清检测效价麻疹病毒
4. 23 ± (). 27
V ero 细胞
麻疹血清无病变空白血清
4.2聰腺炎病毒4. 99 ±0.50
V ero 细胞
麻疼血清 4. 7空白血清
4. 9风疹病毒
4. 31 ±(>.29
RK-13细胞
麻疹血清 4. 2空白血清
4.3水痘病毒
4. 09 ± (). 28M RC-5细胞
麻疼血清 4. 1空白血清
水滴石穿的近义词和反义词4. 0
3讨论
商业化的麻疹病毒抗血清或单克隆抗体多是用
于E L IS A 和蛋白质印迹法等，有较高的结合活性， 但中和活性往往不理想，无法满足疫苗检定工作的 使用需求。中和法是经典的疫苗有效性检测方法， 更能体现出产品的免疫原性，能否保证抗血清的持 续供应非常关键。
中国药典2()2()年版三部人用疫苗总论中规 定，外源因子检测如需进行病毒中和，应避免抗血清
图1麻疹病毒抗血清对不同细胞细胞毒性影响（1⑶X) A V ero 细胞血清组B RK-13细胞血清组C MRC-5细胞血清组L > Vero 细胞对照组E RK-13细胞对照组F MRC-5
细胞对照组
中存在中和潜在外源因子的抗体.使用特异性单克 隆抗体可最大限度避免这种偶然性。如使用动物免
疫血清中和病毒，应使用非疫苗生产株病毒免疫无 特定病原体级动物制备的血清；人类血清抗体谱较 广，不宜用作外源因子检测时中和用抗体。
另外，法规对检定用抗血清的中和效价以及特 异性均提出了一定要求。W HO要求用于麻疹-腮 腺炎-风疹联合减毒活疫苗中病毒滴度测定的抗血 清中和效价不低于1 : 320[2]。动物血清中可能有 不明确的成分，可能会影响检定用细胞的状态，进而 影响检定结果。较高中和效价的抗血清，经足够的 稀释比例后，可将影响降低，进而可用于麻疼-腮腺 炎-风疹联合减毒活疫苗和麻疹-腮腺炎-风疼-水痘 联合减毒活疫苗[7_8]的检定。
本实验使用非疫苗生产株麻疹病毒Edm-3株 免疫豚鼠及家兔，结果抗血清中和效价均在1: 320 以上，并无细胞毒性，特异性高，能满足法规和试验 需求。实验设置的4个组别制备的抗血清中和效价 有一定差异，其中豚鼠组高于家兔组，背部皮下多点 组高于腹腔组，这可能是由于豚鼠和家兔对于麻疹 病毒免疫灵敏度有差异；背部皮下多点免疫途径相 较于腹腔免疫途径，免疫原能更缓慢释放、更长久地 刺激动物免疫系统[5]；也可能是皮下有较多的A PC，抗原能得到更高效的识别、加工、提呈M，因此 能制备得到更高中和效价的抗血清。
此次实验证明，采用麻疹非生产株病毒收获液，经初步纯化后，加入弗氏佐剂，经背部皮下多点免疫 豚鼠3次，可得到更高效价的、能满足使用需求的麻疹抗血清。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期:2020-08-19)
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