朱登云 田慧琴 蒋金火 谷文英 汪 矛 朱 湄 米景九 李浚明
(中国农业大学生物学院，北京 100094)
摘 要: 杜仲成熟干种子经GA3溶液浸泡后，去掉种胚，切取胚根端胚乳接种在愈伤组织诱导培养基上,5～7d后多数胚乳顶端局部膨大。将膨大部分切下转入成分相同的新鲜培养基上,40～50d后形成白柔软的初生愈伤组织。初生愈伤组织经改造后变为绿致密具分化能力的愈伤组织，转入分化培养基后出现器官分化，唯正常茎芽分化频率很低，且十分细弱，只有经壮苗培养后才能诱导生根。目前已获得胚乳试管苗20余株。其无性系中部分植株已在温室内移栽成活。
关键词: 杜仲；胚乳培养；植株再生
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)不仅是一种名贵的药用植物，而且是最有开发前景的温带胶源植物。据报道，在杜仲的叶片、树皮、根皮和果皮中都含有杜仲胶[1,2]。杜仲胶是杜仲含胶细胞产生的一种次生代谢物质，具有重要的经济价值和诱人的开发前景[3]。杜仲为二倍体(2n=2x=34)落叶乔木，雌雄异株，异花授粉，以收获树叶和树皮等营养体为主要栽培目的，虽以种子繁殖为主，但也可进行营养繁殖。杜仲具备的
所有这些特点，表明这个树种适于通过三倍化进行遗传改良[4]，以利用细胞体积增大的特点提高单株产叶量或细胞含胶量。
制造三倍体有几种不同方法。在本研究中我们采用了胚乳培养和植株再生的方法。本文报道杜仲成熟干种子胚乳愈伤组织诱导和植株再生的实验结果。
1 材料和方法
1.1 材料 供试材料为采收后晾干的杜仲成熟翅果，大部分购自北京种子市场，一部分由湖北郧西黑山杜仲林场柯昌华先生惠赠。
1.2 接种方法 由褐翅果中剥出的成熟干种子用常规方法灭菌后，先用500～1000mg/L的无菌赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，然后在超净台上将种子沿背腹线切成两半，剔除其中种胚，再将每扇胚乳的子叶端(合点端)3/4淘汰，将占种子全长1/4的胚根端(珠孔端)胚乳种皮朝下接种在愈伤组织诱导培养基上。由于杜仲成熟种子的种皮细胞皆已衰败破损，无生命力[2]，故接种胚乳时无须剥除种皮。
1.3 培养基 在本研究中使用的基本培养基(BM)有2种，其中BM-I为M S无机盐+B5有机物，并添加酵母浸提物(YE)800mg/L和蔗糖30g/L;BM-II为M S培养基。所有培养基皆以0.7g/L琼脂固化，在高压灭菌前将p H调至 5.8。
1.4 培养条件 培养室温度为25±3℃，光照时间16h/d，光照强度1000～1500lx。
1.5 愈伤组织细胞染体观察 挑选继代后10d左右活跃生长的愈伤组织，以8-羟基喹啉和对二氯苯混合液在室温下预处6～12h，卡诺液(3∶1)固定，以浓盐酸-95%乙醇(1∶1)在室温下解离10～12min，铁矾苏木精染,45%醋酸中压片。
杜志国杜淳2 实验结果
2.1 不同部位胚乳细胞对离体培养反应能力的差异 在杜仲成熟种子中，胚乳由大约10层细胞组 *国家自然科学基金(批准号:39570463)及国家科委重点项目资助课题
朱登云：男,36岁，博士，研究方向为植物遗传育种
收稿日期:1998-05-22
成[2]，包裹在胚的周围(图版说明·1)。本研究初期的实验结果反复表明，在离体培养中，并非所有的胚乳细胞都具有反应能力：大部分胚乳细胞体积较大，充满后含物，细胞核解体(图版说明·2)，在培养中迅速褐化，从来不能形成愈伤组织；只有胚根端胚乳顶端的一小部分细胞，体积较小，细胞质浓厚，细胞核完整(图版说明·3)，在培养中才能表现全能性。有鉴于此，在本研究后来的所有实验中，都只切取胚根端的一小部分胚乳接种，这样做既可提高培养基的利用效率，又显著减轻了培养基的褐化程度。
2.2 胚乳愈伤组织的诱导 将经过GA3处理的种子中的胚根端胚乳接种到愈伤组织诱导培养基(成分下详)上5～7d后，多数胚乳顶端局部膨大，形成一种半透明状组织(图版说明·4)。这时为了避免培养基已经出现的褐化现象进一步加剧，须将胚乳的膨大部分切下，及时转移到成分相同的新鲜培养基上。此后再经40～50d培养，部分膨大胚乳即会形成质地柔软的白愈伤组织(图版说明·5)，其中极个别胚乳形成致密的绿愈伤组织。没能形成愈伤组织的膨大胚乳则逐渐褐化死亡。愈伤组织诱导频率(以愈伤组织数占接种胚乳数的百分数表示)取决于以下3个因素的综合作用，在最佳条件下可达40%以上。
(1)胚乳细胞的活化 在杜仲休眠种子中，胚根端胚乳细胞虽然具有形成愈伤组织的潜力，但不经活化处理不可能进入脱分化过程。表1列出了几种处理方法对杜仲成熟干种子胚乳细胞的活化效果，其中所用的愈伤组织诱导培养基为BM-I+ZT(2.0)+N AA(0.5，单位:mg/L，下同)。
表1 不同处理方式对杜仲成熟干种子胚乳细胞的活化效果
Table1 Activa tio n effect o f different t reatments o n endosperm cells
o f dr y ma ture seeds o f Eucommia ulmoides
编号Designation
材料
M aterial
活化处理
Activation treatmen t
接种胚乳数
No.of endosperm
inoculated
愈伤组织数
No.of calli
愈伤诱导频率
/%
Callus
ind.freq.
1离体干胚乳
Dry endos perm
—6000
2离体干胚乳
Dry endos perm
水浸24h
Soak in w ater,24h
6000
3干种子
Dry s eeds
水浸24h
Soak in w ater,24h
771215.6
4离体干胚乳
Dry endos perm
GA3(1000mg/L)浸24h
Soak in GA3(1000mg/L),24h
602 3.3
5干种子
Dry s eeds
GA3(1000mg/L)浸24h
Soak in GA3(1000mg/L),24h
883438.6
由表1中处理1的的结果可见，未经活化处理接种在诱导培养基上的杜仲干胚乳不能增殖，很快褐化死亡。比较处理2和处理4的结果则可知，只有GA3对离体干胚乳细胞有激活作用，水没有这种作用。然而，若是以整个干种子而不是离体干胚乳为处理材料，水浸(处理3)不但能使其中部分胚乳细胞活化，而且以愈伤组织诱导频率表示的活化频率(15.6%)还显著高于GA3溶液浸泡干胚乳的处理(处理4,3.3%)。其原因可能是，水浸种子的结果首先活化了种胚，而活化后的种胚能产生某种或某些生理活性物质，从而又有效地活化了胚乳细胞，即与Brow n等[5]在蓖麻成熟种子胚乳培养中所看到的现象相似。最后，处理5的结果表明，若是以GA3溶液浸泡干种子，在本实验条件下则可取得活化胚乳细胞的最佳效果。此外，图1所列结果指出，在以GA3溶液浸泡干种子时，其对胚乳细胞的活化效果虽会因浓度的不同而不同，但在100～1500mg/L的范围内，效果都显著高于水浸，其中效果最佳的浓度是500～1000mg/L。
(2)激素的种类和配比 在无激素培养基上，活化胚乳虽能膨大，但不能形成愈伤组织。在只补加1种细胞分裂素或1种生长素的BM-I上，愈伤组织的诱导频率很低。通过对两类激素不同组合方式308农业生物技术学报1998年
图1 赤霉素(
GA 3)浸泡杜仲成熟干种子对胚乳细胞的活化效果
Fig.1 Activ ation effect of g ibberellin (G A 3
)t reatment on en-dosperm cells o f dry ma ture seeds 横座标上的0为水浸of Eucommia ulmoides “0”o n the abscissa repr esents soaking in wa ter
的大量筛选，发现只有当激素组合为BAP (1.0)+N AA (1.0),ZT (1.0)+N A A(1.0)或ZT(2.0)+N AA(0.5)时，愈伤组织的诱导频率较高。然而，在激素组合相同的培养基上，不同年份或同一年份不同批次接种，胚乳愈伤组织诱导频率也不尽相同。
(3)有机添加物 适量的有机添加物对杜仲胚乳愈伤组织的诱导和生长具有良好的作用。在补加ZT (2.0)和N AA (0.5)的BM-I 中，添加酵母浸出物
(Y E)，水解酪蛋白(C H)或水解乳蛋白(L H )800mg /L ，都可显著提高愈伤组织的诱导频率(表2)，并可促进愈伤组织的生长。这3种有机添加物之间在效果上没有明显差异。
2.3 愈伤组织改造与愈伤组织增殖
刚形成的白松软愈伤组织不仅生长缓慢，而且没有分化能力，只有把它们转到激素水平和配比改变为
ZT(1.0)和N AA(1.0)的BM-I 上继代1～2次之后，其中一部分才能转变成绿致密具分化能力的愈伤组织(图版说明.6)，其余未完成状态转变的愈伤组织可在相同培养基上继续继代培养。然后，在补加BA(2.0)和N A A(0.5)的BM -I 上，可通过反复继代使这种绿愈伤组织不断增殖。对这些愈伤组织所做的细胞学观察证实，一半以上(53.3%)细胞的染体数为2n=3x=51(图版说明.7)，表明这些愈伤组织确系由胚乳细胞起源的。表2 有机添加物对杜仲成熟干种子胚乳
愈伤组织诱导频率的影响*
Ta ble 2 Effec t o f o rga nic additiv es on endo sper m callus inductio n
fr equency of dry matur e seeds of Eucommia ulmoides *
添加物
Additives (800mg /L )
接种胚乳数No .of endos perm
inoculated
愈伤组织数No .of Calli
愈伤诱导频率/%Callus ind .freq .
-871820.7YE 873843.7C H 944042.6L H
96
46
47.9
*培养基M edium :BM -I +ZT (2.0)+N AA (0.5)
2.4 茎芽的分化 绿致密愈伤组织在补加BA(1.2)和N AA(0.15)的BM -I 上经过3～4次继代(继代间隔时间为3～4周)之后，即可见器官的分化，分化频率为2%～5%，只是其中多数都是单生或丛生的叶片或十分细弱的畸形苗，正常苗的分化频率很低，只有0.1%～0.01%。未分化的愈伤组织在相同培养基上继续继代，仍可不断分化，其分化能力可保持1年以上。
为了提高杜种胚乳愈伤组织的分化频率，我们试验了各种理化方法，其中以在含有BA (2.0)和
N A A(0.15)或BA(2.25)和N AA(0.2)的BM-I 中再添加4%～6%PEG 4000效果最为显著，可使分化频率提
高到40%～50%，只是所分化出来的器官全部表现玻璃化，几乎无一正常。对这个问题还在继续研究之中。
2.5 再生植株的壮苗与繁殖 刚分化出来的胚乳再生植株比较细弱(图版说明·8)，不宜马上诱导生根，而须首先把它们连同基部的小块愈伤组织一起，转入补加BAP(1.25)和IBA(0.3～0.4)的
BM -Ⅱ中，进行壮苗培养。获得壮苗(图版说明·9)以后，如需进行扩繁，可把它们转入其中BAP 浓度不变,IBA 浓度下降到0.2～0.25mg /L 的BM -Ⅱ中，以促使苗的基部产生侧芽。然后切下这些侧芽,
309
第4期朱登云等：杜仲成熟干胚乳愈伤组织的诱导和植株再生
310农业生物技术学报1998年
图版说明Ex planatio n of pla te
1.杜仲成熟种子纵切面(×4.5);
2.子叶端胚乳细胞，体积较大，充满后含物(油滴)，未见细胞核(×250);
3.胚根端胚乳细胞，体积较小，无后含物，细胞质浓厚，细胞核完整(×400);
4.在愈伤组织诱导培养基上胚根端胚乳顶端局部膨大(×10);
5.由膨大胚乳形成的白柔软的初生愈伤组织;
6.初生愈伤组织经改造后形成的绿致密愈伤组织;
7.愈伤组织细胞染体数,2n=3x=51;
8.绿致密愈伤组织分化正常茎芽;
9.经壮苗培养后的胚乳再生植株;10.胚乳再生植株生根;11.在温室内栽入花盆5周后的胚乳植株
1.Alongitudinal s ection of a m ature seed of Eucommia(×4.5);
2.Endosp erm cells at the cotyled on end of a s eed:large and filled w ith ergas tic subs tance(oil drops),n ucleus not seen(×250);
3.End osperm cells at th e radicle end of a seed:s mall,cytoplas m thick,nu-cleus clearly seen,with no ergas tic s ubs tance(×400);
4.Partial sw elling at th e tip of th e radicle-end end osperm on callus induction medium;
5.W hitish and soft primary callus evolv ed from the s w elling endos perm;
6.Green compact and regen erable callus reformed fo rm th e primary callus;
7.Sh owing th e ch romosome numb er in a callus cell,2n=3x=51;
8.A normal regeneran t redifferen tiated from the green and com pact callus;
9.An end os perm-derived plantlet;10.Rooting of an endos perm-d erived plan tlet;11.An en-d osperm-derived plant5w eeks after potting in th e green h ous e.
再转回到壮苗培养基中，这样通过对培养基中IBA 浓度的细心调节，即可达到壮苗和无性繁殖的双重目
的。然而，在上述壮苗培养基中，若以N AA 代替IBA ，胚乳苗不但生长缓慢，而且还常常掉叶死苗，其原因尚有待探讨。
2.6 再生植株的生根 选择生长健壮的胚乳再生植株，切掉其基部的愈伤组织，然后将切口一端浸泡在250mg /L 的无菌ABT 生根粉溶液中3～5s，再插入无机盐和蔗糖浓度减半的无激素BM -Ⅱ中,2～3周后，在苗的基部长出1～3条白粗壮的不定根(图版说明·10)。
通过以上工作，我们迄今已由杜仲成熟干胚乳培养获得了20余株再生植株，经试管内无性繁殖，无性系体总量达1000余株，并已在温室中移栽成活120株(图版说明·11)。这些植株在移栽后的性状表现及染体倍性变异情况，我们将另文报道。3 讨论
3.1 关于成熟干种子胚乳离体培养的可行性 自70年代初以来，通过胚乳培养获得完整再生植株的被子植物已有分属于11个科的20个物种[6,7]
，其中19个物种都是采用未成熟或近成熟胚乳为外植体获得成功的；在成熟胚乳培养中发生细胞增殖或不完全器官分化的植物虽有蓖麻和麻疯树等数种，但获得完整再生植株的植物只有罗氏核实木[8]和水稻[9]2种。本研究的结果与罗氏核实木又不完全相同，在后者的胚乳培养中，外植体是取自新采收的成熟果实中的种子，而在本研究中则取自成熟后采收晾干并经过相当长时间(1～10个月)贮存的干果实中的种子。因此，本研究的特点在于证明了成熟干种子胚乳培养的可行性，其成功的条件是:(1)在胚乳中存在1
个细胞核完整、后含物较少的有生命力区域,(2)以适当方法活化这个区域中的细胞。
3.2 关于“胚因子”的作用 在胚乳培养研究中，有关“胚因子”的作用问题一直受到人们的关注。由已有文献和本研究结果看来，在胚乳愈伤组织诱导过程中是否必须有原位胚的参与或代之以GA 3处理，主要取决于接种当时胚乳的年龄或生理状态。处在旺盛生长阶段的未成熟胚乳，只要培养条件合适，无须胚的参与就能脱分化而形成愈伤组织，这已被苹果[10]、猕猴桃[11,12]、柚[13]、橙[14,15]和核桃[16]等的胚乳培养结果所证实。有关成熟胚乳培养的成功报道不多，但本研究的结果支持Sriv astav a [8]在罗氏核实木胚乳培养研究中阐述的观点，即原位胚的参与或代之以GA 3处理对于成熟胚乳愈伤组织的诱导是必须的。Baja j [9]
在水稻成熟胚乳培养中虽然既未带胚培养也未进行GA 3处理，但在接种之前整个种子曾经水浸24h，因此可以认为是通过胚的活化而活化了胚乳(见本文 2.2.1)。如果接种时胚乳的生理状态介于上述二者之间，在无胚存在时可以形成愈伤组织，在有胚存在时则可显著提高愈伤组织的诱导频率，顾淑荣等[17]在枸杞胚乳培养研究中报道的结果即可能属于这种情况。此外，文献报道和本研究结果还表明，成熟胚乳细胞一经活化之后，即无需“胚因子”的继续存在而可在适宜的培养基上进行增殖。至于在某些物种(如芸香科的柚[13]和橙[14,15])中,GA 3能促进胚状体的发育和成熟，则属于另一个范畴的问题。
致谢: 本研究得到中国杜仲综合开发协会陈光友秘书长和美国孟山都公司蔡体树女士等的大力支持，谨此致谢。
参 考 文 献
1 周政贤.中国杜仲.贵州：科技出版社,1993,172～185
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4 Dewey D R .诱导多倍体在植物育种中的一些应用和误用.见∶L ewis W H 主编，鲍文奎等译.多倍体在植物和动物中的地位.贵阳：贵州人民出版社,1984.337～354.
5 Br ow n D J,Canv in D T ,Zilkey BF.G row th and me ta bo lism of Ricinus communis e ndosperm in tissue cultur e.Can
J Bot ,1970,48
∶2323～23316 朱登云，李浚明.被子植物胚乳培养研究的历史与献状.农业生物技术学报,1996,4(3):205～216
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第4期朱登云等：杜仲成熟干胚乳愈伤组织的诱导和植株再生
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