（北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100176）
摘要：目的：建立高效液相谱法同时测定白茶中6种茶多酚类物质含量的方法。方法：采用Agilent C18（250mm×4.6mm，5.0μm）谱柱，流动相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸甲醇溶液；柱温：40℃；流速：1mL/min；检测波长：280nm；进样量：2μL；梯度程序：0min（85%A+15%B），60min （70%A+30%B）。结果：建立同时测定茶叶中6种茶多酚高效液相谱定量分析方法，范围内线性关系良好。结论：利用响应面法优化茶叶中茶多酚提取工艺，采用高效液相谱法同时测定不同茶叶中6种茶多酚活性成分，此方法可用来进行不同种类茶叶中茶多酚提取及定量分析研究。
关键词：茶多酚；高效液相谱；响应面；定量测定
中图分类号：O657.7+2/TS272 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）05-0074-09 doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.05.012
Simultaneous determination of 6 kinds of polyphenols in
tea by HPLC
YU Ran，LI Ye*，JIN Li-hua，CHEN Liang，FAN Ying，LIU Rui，LI Jie （College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100176）
Abstract：Objective：In order to establish a method for simultaneous determination of six kinds of tea polyphenols in white tea by HPLC. Methods：parameters for using HPLC were：Agilent C18（250mm × 4.6mm，5.0μm）column，Mobile phase：A：0.3% formic acid solution；B：0.3% formic acid methanol solution，the column temperature 28℃，the injection volume 2μL，flow rate 1.0mL/min，and detection wavelength 280nm. Results：The methods of simultaneous determination of 6 kinds of polyphenols in tea by HPLC was established. Conclusion：response surface methodology was used to optimize the extraction process of tea polyphenols in white tea. High performance liquid chromatography was used to determine the six active components of tea polyphenols in different tea. This method can be used to study the active components of tea polyphenols.
Key words：polyphenols；HPLC；response surface；quantitative determination
茶叶是中国传统植物来源饮品，具有悠久的饮用历史。茶叶中富含多种营养成分和挥发性物质，其主要活性物质含量随产地不同而有所差异，有效成分的种类和含量成为茶叶品质的重要
收稿日期：2021-01-14
基金项目：北京市教委科技一般项目（KM202010858002），天然产物国家标准样品研制及产品开发技术研究（SG030801）。作者简介：于然（1983-），女，博士研究生，研究方向：药物分析。
*通讯作者：李晔（1982-），女，博士研究生，研究方向：基因工程，酶工程。
评价依据［1］。根据茶叶采集和制作形式的不同可以分为绿茶、红茶、黄茶、青茶（乌龙茶）、黑茶和白茶6大类。茶叶中最主要的抗氧化活性成分为茶多酚（Tea polyphenols，TP），茶多酚是一大类多羟基酚类化合物的总称，除此之外，茶叶中还包含有、氨基酸、茶多糖和维生素等营养成分。茶多酚约占茶叶干重的20% ～30%，是茶叶中最重要抗氧化保健成分［2］。茶多酚主要包括黄烷醇类、花苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，其中主要的挥发性成分是儿茶素类化合物约占60%～80%，包括儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子酸和等［3］。茶叶中茶多酚种类和含量随季节不同而变化，春季茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）含量要高于秋季［4］。茶多酚具有抗氧化、调节免疫、解毒、抗辐射和抗疲劳等多种功效，但其组成及含量随品种、采摘季节期及产地等多方面的影响［5］。茶多酚通常从茶叶中提取，其中儿茶素类化合物占茶多酚的 60%～80%，其次是黄酮类，其他酚类物质较少［6-7］。
茶多酚除存在在茶叶、茶树花等多种茶树资源中［8］。沙棘中茶多酚根据提取工艺不同含量可以达到1
1.3%～16.9%［9］。茶多酚也是核桃和枇杷中活性成分［10］。毛枝连蕊茶中绿叶和红叶植株叶片中可溶性糖、茶多酚和总花青苷［11］。
茶多酚易溶于热水、乙酸乙酯、乙醇，微溶于油脂，难溶有机溶剂。茶多酚具有一定的吸湿性，可进行络合反应、氧化还原反应等［12］。纳米磁珠可以实现茶多酚的快速提取分离［13］。茶叶中茶多酚在提取过程中特别是加热时可能受到破坏，在定量分析的过程中需建立可靠的分析方法实现定量。
儿茶酚中不同成分含量是进行茶叶品质等植物鉴别的重要依据。茶多酚为多酚类物质具有天然抗氧化能力，在提取过程中可能会发生氧化还原反应，所以合适的提取工艺条件对茶多酚的定量检测至关重要。分光光度法是测定多酚类物质含量的常用方法，主要包括紫外分光光度法［14］。主要活性成分茶多酚、总皂苷、总黄酮和总多
糖［15］。茶多酚可以采用红外光谱法进行定性和定量检测［16］。液相谱质谱法测定茶叶中茶多酚操作更为复杂［17-18］。紫外分光光度法测定相对灵敏度较低，红外光谱法的定量测定属半定量，茶多酚中多酚类物质结构接近均为儿茶素类结构，同时茶多酚中多种活性成分物质的种类和含量以及比例对评价茶叶品质和进行其他含有茶多酚植物品种鉴别具有重要意义。
本研究利用高效液相谱法建立了同时测定6种主要茶多酚的同时定量分析方法，该方法可以用于茶叶等植物产品中茶多酚种类及含量的检测，对植物鉴定和品质确认具有重要意义。白茶属于轻微发酵茶，
绿茶属未发酵茶，均属我国六大茶品种。白茶因独特的健康价值及可陈放的特点而受到消费者和投资者的青睐，产销量与市场占有率不断攀升，2013 年～2016 年，全国白茶年产量连续四年保持了15 %左右的增幅［19］。不同提取条件对茶叶中主要成分的溶出有影响［20］。本研究利用响应面法优化茶叶中不同提取方法的提取工艺，选择最优提取工艺，在此基础上利用高效液相谱完成不同茶叶中茶多酚种类和含量定量测定，为茶叶品种和植物类型鉴别提供重要的方法学支持。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
没食子酸标准品（纯度均≥98%）、没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%）、表儿茶素标准品（纯度均≥98%）、表没食子酸儿茶素标准品（纯度均≥98%）、表儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%）、表没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品（纯度均≥98%），福林酚试剂（分析纯），甲醇（谱纯）、甲酸（谱纯）、无水乙醇（分析纯），试剂均购自阿拉丁公司。白茶样品：贡眉白茶（产地福建福鼎，2018年），绿茶样品：竹叶青（产地四川）。
1.2 仪器与设备
高效液相谱（Agilent 1260）：安捷伦科技（中国）有限公司；分析电子天平（AR224CN）：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；超声波清洗机（SB-120DT）：上海予腾生物科技有限公
司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：上海凌科实业发展有限公司；中药材粉碎机（DFT150）：上海新诺仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-1800PC-DS2）：上海美谱达仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
取茶叶样品粉碎，准确称取0.5g茶叶粉碎过80目筛，干燥至恒重待用。
1.3.2 提取工艺优化
本实验利用响应面法优化茶叶中茶多酚提取工艺。1.3.2.1 单因素实验选取超声提取和热水浸提两种提取方法，提取时间、提取温度、固液比、溶剂浓度4个单因素，利用单因素实验确定提取条件范围。
1.3.
2.2 CCD响应面法提取根据单因素试验结果，分别选取温度、乙醇浓度、提取时间作为响应变量，变量的水平以-1、0、1 表示，以茶叶提取物中总酚含量为响应值，利用软件Design-Expert 8.0.6 进行三因素三水平实验设计和数据分析。茶叶中茶多酚提取配方优化试验设计如表1所示。
表1 响应面法优化提取工艺试验设计
Table 1 Optimization of extraction process by response surface methodology
NO时间温度/乙醇浓度（热水浸提/
乙醇提取）固液比NO时间
温度/乙醇浓度（热水浸提/
乙醇提取）
固液比
10.000-1.6820.00011-1.000-1.000 1.000 20.0000.0000.00012 1.000 1.000-1.000 3 1.000-1.000 1.00013-1.6820.0000.000 40.0000.000-1.682140.000 1.6820.000
5 1.6820.0000.000150.0000.0000.000
6 1.000 1.000 1.000160.0000.000 1.682
7 1.000-1.000-1.000170.0000.0000.000 80.0000.0000.00018-1.000 1.000-1.000 9-1.000-1.000-1.000190.0000.0000.000 10-1.000 1.000 1.000200.0000.0000.000
1.3.
2.3 总酚含量的测定准确称取没食子酸标准品200mg加少量70％乙醇将样品溶化，用70％乙醇定容至100mL摇匀，静置。再用移液器吸取20mL，用70％乙醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为400μg/mL的没食子酸标准溶液，待用。准确吸取没食子酸标准溶液0mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL于试管中。分别加入蒸馏水2.0mL、1.95mL、1.9mL、1mL、1.85mL、1.8mL、1.75mL再各加入福林试剂1mL，充分振荡后静置3～4min，分别加入10％碳酸钠1mL于25℃，摇匀置于恒温水浴中反应2h，同时做试剂空白，于765nm下测定吸光度，以含量对吸光度进行直线回归，计算回归方程。将提取液离心，取上清液，按标准曲线绘制的测定方法，依次加入试剂，以试剂空白作参比，在765nm处测定吸光度，计算茶多酚含量作为响应值。
1.3.3 茶多酚标准溶液配置
分别称取对照品没食子酸、没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品0.1g，精密称定后分别置于100 mL 容
量瓶中，甲醇溶液稀释至刻度，摇匀后即得对照品溶液1.00mg/mL，置于-20℃冰箱中，备用。1.3.4 谱条件选择
Agilent C18谱柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流动相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸甲醇溶液；柱温：40℃；流速：1mL/min；检测波长：280nm；进样量：10μL；梯度程序：0min（85%A+15%B），60min（70%A+30%B），DAD检测器。
1.3.5 方法学测定
1.3.5.1 线性分别取没食子酸、没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素没食子酸酯储备液，配制成
2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、100.00μg/mL的系列标准工作液，高效液相谱仪进样测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。
1.3.5.2 检测限和定量限分别测定6种茶多酚检测限和定量限，检测限S/N为3，定量限为3倍检测限。
1.3.5.3 精密度分别配制没食子酸、没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素没食子酸酯标准品溶液，按实验条件，平行测定6次。
1.3.5.4 加样回收率分别取6种茶多酚标准溶液加入1mg标准品，进行加样回收率计算。
1.3.6 供试品制备
供试品茶粉0.5g，根据最优提取方法分别制备热水浸提溶液和醇提取液各5mL，样品采用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液，置-20℃冰箱中保存备用。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
茶叶中总酚含量随时间、温度、固液比和乙醇浓度变化见表2。根据单因素实验确定响应面法优化热水浸提条件提取时间10～50min，温度60～100℃，固液比为4～8（mL/g），乙醇提取条件为时间20～60min，乙醇浓度0%～100%，固液比为4～9（mL/g）。
表2 单因素提取试验
白茶的种类主分为四类Table 2 Single factor test for extraction 序列时间温度固液比乙醇浓度吸光值11010081000.241 2501004500.305 3308061250.29 430806750.336 550604500.352 630806750.342 730802750.372 830806250.334 9501008500.271 1030406750.337 11301006750.333 1210608500.304 1330806750.307 141010041000.364 151********.373 1630806750.339 175010081000.272 1810604500.345 190806750.162 2050608500.31 215010041000.328 22106041000.283 2330801075
0.294 2470806750.336 25506041000.291 2630806750.339 2730806750.344 28506081000.131 29101008500.252 30106081000.157
2.2 响应面法优化提取工艺2.1.1 热水提取工艺
根据响应面法优化，确定提取温度为80℃，
固液比为6∶1（mL/g ）；提取时间为29min ，过滤取滤液，最优条件多酚含量为13.47mg/mL 。
0.35
0.340.330.320.310.290.28
0.3R 1
60.00
68.0076.00
84.00
B ：温度B ：温度
A ：时间
92.00100.0060.00
68.00
76.00
84.0092.00100.0050.00
42.0034.0026.0018.0010.00
0.380.360.340.320.30.260.240.280.380.360.340.320.30.260.240.28R 1R 1
8.00
7.00
6.00
8.00
7.00
6.00
C ：固液比C ：固液比
A ：时间
5.005.00
4.004.0010.0018.0026.00
34.0042.0050.00图1 响应面法优化热水浸提工艺
Figure 1 Optimization of hot water extraction process by response surface methodology
2.1.2 超声醇提取工艺
准确称取0.5g 茶叶粉碎过60目筛的恒重茶粉末，根据响应面法优化，确定溶剂乙醇浓度
50%，固液比6.5∶1（mL/g ），提取时间40min ，过滤取滤液，最优条件多酚含量为11.30mg/mL 。
R 1
100.00
75.00
50.00
25.00
B ：乙醇浓度
A ：时间0.000.40.30.20.100.40.30.20.10R 1
4.00
5.00
6.00
C ：固液比
A ：时间7.008.009.0060.00
52.0044.00
36.0028.0020.00
60.0052.0044.0036.00
28.00
20.00
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