5种布鲁氏菌病ELISA抗体
检测的比菊
虞一聪，桂平雄，倪柏锋，王雅婷，董建斐，周蕾，
娟，谢，赵，徐
(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州311199)
摘要：为提高布鲁氏菌病检测诊断能力，采用5种布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)试剂盒对背景清楚的166份牛、羊、猪血清样本进行检测，同试集试验(SAT)作为照方法，5试剂盒的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值等参数。结果显示,5种试剂盒的敏感性为88.00%-100.00%；特异性为86.21%-99.14%；Youden 指数为86.21%~95.69%;AUC值为0.931~0.978；McNemac检验结果显示,5种试剂盒中厂家A、C和E检验结果与SAT 结果差异不显著(P>0.05)，厂家B和D检验SAT结果差异显著(P<0.05);Kappa一致性检验分析表明,5种试剂盒与SAT结果均有高度的一致性(0.790~0.930)；成本-效果分析表明,5种试剂盒优先选择依次为A、C、B、E、D%本试验结为诊断用试剂，从而提高诊断准确性。
关键词：布鲁氏菌病；竞争ELISA；试剂盒；比较
中图分类号：R378.5文献标志码:A文章编号：0529—6005(2020)12—0036—04
Comparison of5cELISA Kite for Detecting AnhCodiet of Brucellosis
YUYc-cong,GUIPcng-xcong,NIBac-eeng,WANGYa-ecng,DONGJcan-eec,
ZHOULec,CHAIJuan,XIERong-huc,ZHAOLcng-yan,XUHuc
(Zhejiang Provincial Center for Animal Disease Control,Hangzhou311199,China)
Abstract:To improve the ability of detection and diaanosis of brucellosis,five cELISA kits were used to detect166serum samples for brucellosis antibodies from cattle,sheep and pigs with a cleac background.Meanwhile,tbe sensitivity,specificity,Youden's J vaeue&and AUCvaeue&oeeheecvekceweoedeeeomcned bySATa&aoeeeoencemeehod.Theoe&uee&howed ehaeehe&en&cecvceyoeehe five kiw was88.00%〜100.00%；the specificity was86.21%-99.14%；the Youden&s J vvlue was86.21%-95.69%；the AUCvaeuewa&0.931〜0.978.McNema o ee&e oe&u ee&howed no&cgnceccane&eaececcaedc e oencewa&ob&eoved beeween eheoe&ueeoe manufacturers A,C,and E with SAT results(P>0.05),while significant dWerence was observed between the SAT results of manu-factuer B and D(P<0.05).Kappa consistency test analysis showed that the five kiw were highly consistent with SAT results (0.790〜0.930).The cos e-e i ec ecvene s ana eys cs showed ehaeehepocooceyoieheicvekceswasA,C,B,Eand D.Theseoesueeswc e provide a reference for the selection of diaanostic kits,thereby improving the diaanostic accuracy.
Key words:Brucellosis；cELISA；kit；comparison
Corresponding author:XU Hui,E-mail:****************
布鲁氏菌病!Bruce/osW，简称布病)是由布鲁氏
牛、羊、猪、鹿、乳动物和人类感染的一种人兽共患传染病[1]%家畜感染后畜生流产、早产、，公畜炎和附睾炎，殖能力和生产能降，畜
收稿日期：2020—06—04
基金项目：浙江省农业重大技术协同推广计划(2019XTTGXM02-4)；浙江省"三农六方”科技协作项目(CTZBE180706LWZENY1)
：一(1989-)，男，兽医师，硕士，主要从事动物疫病监测工作,E-mail:jordanyuyicong@163-com
:,E-mac:****************产品的质量和安全[2]%上170多个国家和地区先生人兽布病疫情2050年代布病曾在我国广泛流行，疫情严重地区人畜感染率达50%%20世纪80—90年代，由于防 度加大，疫情降低水平％自2000年，人兽共患布病疫情年上，对畜牧业构成了严重威胁⑷％动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T18646)在更新至2018年版后，增加竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)作为血清学确诊试验％因试集试验(SAT)操作繁琐、耗时,cELISA较SAT具有更高的特异性，便、判％为此，作
SAT作为参照方法，选择5个厂家cELISA试剂盒进行比对试验，根据检测结果分析评价各试剂盒的检测性能，为本实验室选择诊断用试剂盒提供参考。
1材料与方法
1.1血清试验血清选取背景清楚的血清共166份，其中牛血清111份洋血清43份，猪血清12份，均于浙江省动物疫病预防控制中心实验室-20j保存。
1.2试剂盒5种布鲁氏菌病抗体cELISA试剂盒，分别为A试剂盒（批号:18121701）、B试剂盒（批号：181120）、C试剂盒（批号：020161903）、D试剂盒（批号：20190619）、E试剂盒（批号：110718），分别购自国内外5家公司。试管凝集试验阴、阳性血清和抗原，均购自青岛立见诊断技术发展中心％
1-3主要仪器酶标仪（Tecan Infinite F50），洗板机（Tecan Hydra Speed），恒温箱（BINDER KB115），离心机（Eppendoi5424），移液（Eppendoi），微量振荡器（海门其林贝尔MH-2），生物安全柜（Thermv 1300SERIES A2），高压灭菌器（TOMY SX-700）%
1-4检测方法
1.4.1SAT按动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/L 18646-2018）进行操作及结果判定％
1.4.2cELISA严格按照各试剂盒说明书进行操作并按要求判定结果，平行检测所有血清样品，且各试剂盒均在有效期内并试验成立％
1.5数据统计与分析采用四格表法分别对各试剂盒检测结果与SAT进行两两比较分析（表1））5*，并利用SPSS25-0、MedCatc19-0等软件将检测结果进行统计与分析，采用X检验！McNemar法）对检测 样品进行显著性差异分析,P<0-05表示差异显著, P>0.05表示差异不显著，采用Kappa一致性检验对准确性进行分析％
表1评价诊断试验的四格表
Table1Fourfold table for evaluating diagnostic tests 被评价方法_______________________空_______________________合计Evaluation method阳性Pottive阴性Neaative Total 阳性真阳性a假阳性b
a+b Positive True positive Fals c positive
阴性假阴性c真阴性d
c+d Neaative False neaative True neaative
合计Total a+c b+d N 1-6成本-效果分析本试验以每份样品检测费用
作为成本指标，以检测时间（计孵育时间，加样和洗
板时间暂不计入）作为效果指标，检测费用越少、检
测时间越短表明检测效率越高％以每份样品检测
费用的倒数与检测时间的倒数之积作为单位成本
检测效率值，值越大表明试剂盒越好，通过比较单
位成本检测效率值来判定各试剂盒优劣％
2结果
2.1检测结果对实验室留存的166份血清分别
采用试集试验5家病抗体cELISA试
剂盒进行检测，结果见表2、表3%
表2试管凝集试验检测结果
Table2Detection results of SAT
血清种类Serum type
SAT
+-
牛Bovine3774 Sh p1330猪Pn012合计Total50116
Table3cELISA detection results of five kite
表35种试剂盒cELISA检测结果
cELISA试剂盒
cELISA kit
SAT
+
-合
Total A
+50555
-0111111 B
+50656
-0110110 C
+44145
-6115121 D
+501666
-0100100 E
+49554
-1111112合50116166
2.2检测结果分析5种试剂盒的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值见表4%由表4可知，厂家A、B、D敏感性最高（100-00%）；厂家C特异性
最高(99.14%)。厂家A的Youden指数和AUC值最大，分别为95.69%和0.978，表明其诊断准确性最好、诊断价值最高。5种试剂盒的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和阳性似然比(+LR)(阴性似然比！-LR)见表5。厂家A、C、E的PPV较高，表明检出真阳性的概率更大；厂家A、B、D的NPV均为100.00，表明检出真阴性的概率更大。厂家C的+LR最大，表明检测结果阳性时为真阳性的概率最大，即证实疾病的能力最强。厂家A、B、D 的-LR均为0.00，表明检测结果阴性时为真阴性的可能性更大，即排除疾病的能力越好。
表45种cELISA试剂盒敏感性、特异性、Youden指数及AUC值结果
Table4Resulte ot sensitivity,specificity,Youden*s J value and AUC value ot five cELISA kits
cELISA试剂盒敏感性/%特异性/%Youden C%AUC cELISA kit Sensitivity SpecificPy Youden's J value AUCvaeue
A
100.0095.69
95.69
0.978
(92-90-100.00)
(91.94〜99.44)(0.943〜0.995)
B
100.0094.83
94.83
0.974 (92.90〜100.00)
(90.74-98.92)
(0.937〜0.992)
C
88.0099.14
87.14
0.936 (78.67〜97.33)(97.43〜100.00)(0.887〜0.968)
D
100.0086.21
86.21
0.931 (92.90〜100.00)(79.84〜92.58)(0.881〜0.965)
E
98.0095.69
93.69
0.968 (93.98〜100.00)(91.94〜99.44)(0.929〜0.989)
注：括号内数值为95%置信区间；下表同
Note:The values in parentheses are95%confidence inteeals.The same as below
表55种cELISA试剂盒阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比、阴性似然比结果Table5Results of positive prodictive value,negative prodictive value,positive lidelidood
ratio and negative likelidood rotio of five cELISA kits
cELISA试剂cELISA kit PPVC%NPVC%
+LR-LR
A
90.91
(83.07〜98.75)
89.29
100.00
23.20
(9.80〜54.70)0.00
19.33
B100.000.00
(80.93〜97.64)(8.90〜42.10)
C
97.7895.04102.080.12 (93.30〜100.00)
(91-12-98.97)
(14.50〜720.50)(0.06〜0.30)
75.767.25
D(65.14〜86.37)100.00(4.60〜11.40)0.00
E
90.7499.1122.740.02 (82.75〜98.73)(97.34〜100.00)(9.60〜53.60)(0.003〜0.10)
2.3符合情况分析5种试剂盒与SAT之间的符合情况见表6。McNemar检验结果显示,5种试剂盒中厂家B和D的检验结果与SAT结果差异显著(P<0.05)，厂家A、C和E的检验结果与SAT结果差异不显著(P>0.05)；Kappa—致性检验分析表明,5种试剂盒的检验结果与SAT结果均有高度的一致性(0.790~0.930)，其中厂家A—致性最高(0.930)。
2.4成本-效果分析经成本-效果分析，5种cELISA试剂盒成本-效果分析比较见表7，其中厂家A的效率最高。
表65种cELISA试剂盒血清学检测符合情况比较Table6Comparison of serologicat agroement of
rosults of five cELISA kds
cELISA试剂
cELISAkc
McNemar检验
McNemar test
Kappalisa多高
Kappavaeue A
P r0.063
0.930
B
P r0.031
0.917
C
P r0.125
0.897
D
P<0.001
0.790
E
P r0.219
0.916
表75种cELISA试剂盒成本-效果分析比较Table7Comparison of cost-effectiveness anaeysgs o9gvecELSSAkgts
cELISA 试剂盒cELISA
kit
检测费用/元
Coseoe
detectio n/Yuan
检测时间/分
DetecEon
timc/Min
单位成本检测效率值
[x104/(元•分)]
Uniecosedeeeceion
rfficiency value
[X104(Yuan•min)]
A 4.797527.83
B16.67758.00
C9.3810510.16
D26.04100 3.84
E16.25130 4.70
3讨论
经检测结果分析，厂家A、B、D敏感性最高，均为100%；厂家C特异性最高;5种试剂盒Youden指数均大于86%，表明诊断准确性较好;AUC值均大于0.9，表明诊断价值较高。厂家A、C和EPPV均大于90%，表明检出真阳性的概率更大;5种试剂盒NPV均大于95%，表明检出真阴性的概率较大。厂家C的+LR最大，表明证实疾病的能力最强；厂家A、B、D的多R均为0，表明排除疾病的能力越好。经Kappa一致性检验分析表明,5种试剂盒与SAT 结果均有高度的一致性,McNemar检验结果显示，厂家A、C和厂家E与SAT结果差异不显著(P〉0.05)；厂家B和厂家D与SAT结果差异显著(P< 0.05)。经成本-效果分析，单位成本检测效率值从高到低依次为A、C、B、E、D，表明厂家A的效果最好。
布病流行范围广、危害严重，是我国二类动物疫病。目前，常用的血清学诊断方法主要有RBT、SAT、CFT、iELISA和cELISA五种％由于敏感性和特异性的问题，它们都缺乏“理想检测”的质量，而且没有一种单一检测方法可以适用于所有流行病学情况)6w*%在日常检测中以RBT和SAT为主，但
2种检测方法有较高的假阳性(15%以上)和假阴性(10%以上)，往往出现漏检和误检[8]。世界动物卫生组织(0IE)陆生动物卫生法典中布病确诊指定试验为CFT或cELISA，但由于CFT操作复杂，每次检测需准备红细胞悬液和测定溶血素效价，费时费力成功率又低；而ELISA操作快速、简单，检测结果客观又可靠，且有研究证明,cELISA具有更高的特异性⑷％因此，在布病血清学确诊时亦可选择cELISA%
此外，对于不同检测目的，选择适当的检测策略(平行试验或垂直试验)也尤为重要％按照国家中长期动物疫病防治规划和国家布病防治计划，我国根据布病流行情况和防控策略实行区域化管理，全国多地主要采取“监测、扑杀、隔离、消毒”等相结合的综合性防控措施。选择合适的监测方案是防控布病的前提和关键，在监测、净化过程中使用2种或2种以上检测方法互相验证，既可减少因误杀造成的经济损失，又可降低因漏检造成布病传播风险％有研究表明,RBT和iELISA组合进行平行试验敏感性最好,SAT和cELISA组合进行垂直试验特异性最好[9]%
国家正在积极推进“布病无疫区”和“布病净化场”的建设和评估验收，尤其是对种畜、奶畜的布病净化％在卫生疾病预防和领域，往往通过成本-效益分析(Cost-benefit analysis,CBA)和成本-效果分析(Cost-effectiveness analysis,CEA)来研究和评估方案、策略，从而选出最佳方案[10]%针对养殖场的布病净化，从生物安全经济学角度来看，选择cELISA筛检，前期检测、人力成本会提高，但检测结果可信度却大大提升了，采取的针对性防控措施也更有成效，不仅可以剔除布病，还降低了养殖场生产维护成本，对控制布鲁氏菌病流行，减少经济损失，降低人感染疫病风险具有重要意义％
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