陈浩1，2，3，李振汉4，王明婷5，卢林明3，唐乾利2，罗良平11暨南大学临床医学博士后流动站，广东广州510632；2右江民族医学院研究生学院，广西百533000；皖南
医学院3病理解剖学教研室，4临床医学院，安徽芜湖241002；5
南京市第一医院产科，江苏南京210006
High expression of UBE2S promotes progression of hepatocellular carcinoma by increasing cancer cell stemness
CHEN Hao 1,2,3,LI Zhenhan 4,WANG Mingting 5,LU Linming 3,TANG Qianli 2,LUO Liangping 11
Postdoctoral Research Station of Clinical Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,China;2Graduate School,Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China;3Department of Pathology,4School of Clinical Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China;5Department of Obstetrics,Nanjing First Hospital,Nanjing 210006,China
摘要：目的探究UBE2S 在肝癌微环境不同细胞类型的特异性表达及对肝癌细胞干性的影响。方法使用TCGA 数据库分析肝
癌中UBE2S 转录水平及其启动子甲基化水平差异，使用CPTAC 数据库分析UBE2S 蛋白水平差异。使用TISCH 单细胞测序数据挖掘UBE2S 在不同细胞类型中的表达，并分析细胞通讯的强度以及细胞各自的关键转录因子。免疫组化验证UBE2S 在肝癌组织中的表达；多免疫荧光检测UBE2S 在肝癌细胞以及T 细胞的表达情况。利用shRNA 敲低肝癌细胞HCC-LM3中的UBE2S ，分为shCtrl （对照组）、shUBE2S-1（敲低组1）、shUBE2S-2（敲低组2）3个组，利用克隆形成实验、悬浮成球实验检测UBE2S 敲低对HCC-LM3干性影响。结果UBE2S 在TCGA 数据库中非配对肿瘤组织中高表达（P <0.001），配对肿瘤组织中也高表达（P <0.001），随着肿瘤分级增高，转录水平逐渐增高（P <0.001）；在CPTAC 数据库中肝癌组织UBE2S 蛋白水平表达也增高（P <0.001）；肝癌中UBE2S 启动子甲基化水平降低（P <0.001）；TP53突变组UBE2S 转录水平更高（P <0.001）。单细胞测序结果显示，UBE2S 在T 细胞等细胞高表达；内皮与上皮及成纤维细胞之间的细胞交互强度较高，SMAD1等转录因子可能是Tprolif 细胞关键转录因子。与正常组织相比，UBE2S 在肝癌组织高表达；且在肝癌细胞和T 细胞中均有较高表达。克隆形成实验显示：与shCtrl 组相比，敲低UBE2S 能减少肝癌细胞克隆形成数目（shUBE2S-1，P <0.05、P <0.01；shUBE2S-2，P <0.01、P <0.05）；悬浮成球实验显示：与shCtrl 组相比，敲低UBE2S 能减少肝癌细胞肿瘤球形成数目（shUBE2S-1，P <0.05、P <0.01；shUBE2S-2，P <0.01、P <0.01）。结论UBE2S 在肝癌组织T 细胞中高表达，与预后不良相关，且其能促进肝癌细胞干细胞特性。关键词：单细胞测序；UBE2S ；肝癌；T 细胞
Abstract:Objective To investigate the expression of the ubiquitination enzyme UBE2S in different cell types in hepatocellular carcinoma (HCC)microenvironment and its impact on proliferation and stemness of HCC cells.Methods T
CGA and CPTAC database were used to analyze the transcriptional and promoter methylation levels and protein expressions of UBE2S in HCC.Specific expression patterns of UBE2S,intercellular communication and key transcription factors in different cell types were analyzed based on single-cell sequencing data from TISCH website.We further examined UBE2S expressions in clinical samples of HCC tissues,HCC cells and T cells using immunohistochemistry and immunofluorescence staining.We also tested the effects of UBE2S knockdown on stemness of HCC-LM3and HepG2cells using clone formation experiments and sphere formation assay.Results Analysis based on TCGA database suggested significant overexpression of UBE2S in both paired and non-paired tumor tissues (P <0.001),and its transcriptional level increased with tumor grades.The methylation level of UBE2S promoter was significantly decreased in HCC (P <0.001),and its transcription level increased obviously in HCC with TP53mutation (P <0.001).Analysis of CPTAC database also demonstrated overexpression of UBE2S protein in HCC tissues (P <0.001).Three prognostic models suggested that HCC patients with high UBE2S expression had poorer prognosis (P <0.001).Single-cell sequencing data analysis revealed high expressions of UBE2S in T cells and high intensities of interaction between endothelial cells,epithelial cells and fibroblasts in HCC microenvironment.Immunohistochemistry and immunofluorescence staining demonstrated high UBE2S expressions in clinical samples of HCC tissues,HCC cells and T cells.In HCC-LM3and HepG2cells,UBE2S knockdown significantly inhibited cell clone formation and tumor sphere formation (P <0.05).Conclusion UBE2S is highly expressed in T cells in HCC microenvironment in close correlation with a poor prognosis.High UBE2S expression promotes the stemness of HCC cells.
Keywords:single-cell sequencing;UBE2S;hepatocellular carcinoma;T cells
原发性肝癌在各类恶性肿瘤中发病率排第六位，已
经上升为全球肿瘤第二大死因［1］
；亦是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年增加，肝细胞性肝
癌（HCC ）是主要病理类型［2,3］
。由于HCC 早期症状不明显，发现时绝大部分都会出现远处转移，经整体预后仍然较差［4］。因此，探究HCC 的发病机制，寻有效
收稿日期：2023-09-25
基金项目：国家自然科学基金（81774327）；广西自然科学基金（2021GXNSFBA196039）；安徽省自然科学基金（2308085QH245）；安徽省高校科学研究重大项目（2023AH040261）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81774327).作者简介：陈浩，博士后，副教授，E-mail:**************** 通信作者：唐乾利，教授，主任医师，博士后合作导师，E-mail:htmgx@163 ；罗良平，教授，主任医师，博士后合作导师，E-mail:**************
J South Med Univ,2024,44(3):455-464doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.03.06
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的靶点是亟待解决的问题［5］。泛素结合酶E2S （UBE2S ）是E2泛素结合酶的一种，参与各种病理生理过程［6-8］，与多种癌症联系紧密［9-12］。免疫逃逸是癌症发展的重要标志，肝癌具有多种免疫逃逸机制，因此深入研究肝癌微环境中不同免疫细胞状态以提出针对性的
策略对肝癌的防治具有重要意义［13-16］
。UBE2S 能否通过维持肝癌细胞的干细胞特性从而促进肝癌的进程尚未见报道。因此，本研究拟通过生信分析，挖掘单细胞测序结果，探究UBE2S 在肝癌中的表达与预后的关系，并进一步分析其在各种细胞亚的表达情况，及肝癌微环境中细胞通讯以及细胞内部的关键转录因子等情况；利用临床样本对生物信息学分析结果进行验证，并通过细胞实验探究UBE2S 对肝癌细胞干性的调控作用，该研究有望为肝癌的精准提供新的候选靶点。1材料和方法1.1HCC 标本
本研究使用的人类肝癌组织样本于2022年3月1日~2023年9月31日从弋矶山医院（中国芜湖）获得，并经弋矶山医院医学伦理委员会批准（2022伦审研7号），共10例配对的肝癌组织与正常肝脏样本。1.2数据库分析
从UCSC XENA （xenabrowser/datapages/）下载经Toil 流程统一处理的TCGA 和GTEx 的TPM 格式的RNAseq 数据。提取TCGA 的LIHC （肝细胞性肝癌）和GTEx 中对应的正常组织数据，该数据用于进行非配对样本之间转录水平差异分析。将TPM 格式的RNAseq 数据进行log2转化后在进行样本间的表达比较。通过R （3.6.3版本）和ggplot2[3.3.3版本]进行Mann-Whitney U 检验。从TCGA (portal.v/)下载LIHC 肝细胞肝癌项目中level 3HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 数据，将FPKM 格式的RNAseq 数据转换为TPM 格式并进行log2转化的同时保留配对样本。UNLCAN （ualcan.path.uab.edu/index.html ）是一个可视化包含TCGA 数据库中32个肿瘤和CPTAC 数据的在线网站，本研究从UALCAN 数据库中获取不同分组条件下的转录水平、甲基化差异情况，并基于蛋白组水平分析肝癌组织与正常对照组织的差异。
通过下载肿瘤免疫单细胞中心（TISCH ）网站中的单细胞数据GSE166635，该数据集使用原发肝癌患者的临床样本进行了单细胞RNA 测序（scRNA-seq ）分析。首先利用10x 基因组学从患者中生成了新鲜分离的PLC 的scRNA-seq 图谱。在初始质量控制后，共从两例患者的肿瘤中获得25189个单细胞转录组。使用标准化分析管道MAESTRO 进行质量控制、聚类和细胞类型注释。基于标准过滤细胞每个细胞的UMI 计数
（>1000）和每个细胞的基因数（>500）。为探索组织内不同细胞之间的交流强度，集成CellChat 来推断集之间的细胞-细胞通信。在“CCI ”选项卡中，使用预先计算的交互计数热图来提供这些集之间通信模式的概述。此外，本研究使用LISA 来预测影响不同单细胞RNA-seq 簇中基因表达模式的转录调控因子。热图显示各簇中最高转录因子（TF ）的富集情况，并标记了前10个TF 。1.3细胞和试剂
肝癌细胞株HCC-LM3、HepG2[赛百慷（上海）生物技术股份有限公司]。转染试剂Lipofectamine TM 3000（Invitrogen ），pGCSIL-GFP 载体（上海吉凯公司），敲低UBE2S 的目的序列为shCtrl,5'-TTCTCCGAACGTG TCACGT-3'；shUBE2S-1,5'-CATATGCTGGAGGTCT GTT-3'；shUBE2S-2,5'-GGGCTCTCTTCCTCCTTCC AC-3'，BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），UBE2S 抗体和Tubulin 抗体（Abcam ），CD3抗体和AFP 抗体（Servicebio ）。1.4实验方法
1.4.1免疫组化HCC 组织蜡块连续切片，然后将切片进行脱蜡复水，并在微波炉用柠檬酸盐缓冲液煮沸抗原修复。再通过3%H 2O 2溶液孵育。然后将切片与UBE2S 一抗4℃孵育过夜，随后将切片与山羊兔二抗孵育。最后切片用苏木精复染，脱水，封片。1.4.2多免疫荧光石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，H 2O 2封闭，血清封闭，加AFP 一抗，再加对应HRP 标记的二抗，加对应的TSA ；微波处理，加UBE2S 一抗，加对应HRP 标记的二抗，加对应的TSA ，微波处理，加CD3一抗，加对应的荧光二抗，DAPI 复染胞核，淬灭组织自发荧光，封片，采集图像。
1.4.3肝癌细胞培养与转染肝癌细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO 2温育箱中培养，
取对数生长期的细胞用于后续实验与转染［17］
。
1.4.4免疫印迹法提取总蛋白并通过BCA 法对其含量进行测定。利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳对蛋白进行分离处理，再进行转膜，5%的BSA 室温封闭2h 。孵育UBE2S 及Tubulin 一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，10min/次，加入二抗，室温孵育2h 。TBST 洗膜3次，10min/次，ECL 化学发光显影并拍照。以Tubulin 为内参，使用Image J 软件分析各条带平均灰度值。1.4.5克隆形成实验将细胞分散接种于6孔板中（1×103/孔），培养1~2周。PBS 洗涤后，4%多聚甲醛固定，结晶紫染，PBS 洗涤。直接观察，计算克隆数。
1.4.6成球实验将细胞分散接种于超低吸附六孔板（2×103/孔），使用无血清DMEM/F12培养基，3d/次添加
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F
Expression of UBE2S in LIHC based on TP53muation status
***
***
***
T r a n s c r i p t p e r m i l l i o n
80
6040200
Normal TP53-Mutant TP53-NonMutant (n =50)
(n =105)(n =255)TCGA samples
A
T h e e x p r e s s i o n o f U B E 2S L o g 2(T P M +1)
8
6
4
2
Normal Tumor ***
B
***
T h e e x p r e s s i o n o f U B E 2S L o g 2(T P M +1)
6543210
Normal
Tumor
C
Protein expression of UBE2S in hepatocellular carcinoma
***
Z -v a l u e
42
0-2-4
Normal Primary tumor (n =165)
(n =165)
CPT-AC samples
E
***
Promoter methylation level of UBE2S in LIHC
Normal Primary tumor (n =50)
(n =377)
TCGA samples
B e t a v a l u e
0.080.07
0.060.050.040.030.020.01
Expression of UBE2S in LIHC based on tumor grade
***
*********
T r a n s c r i p t p e r m i l l i o n
70
6050403020100
Normal Grade 1Grade 2Grade 3
Grade 4(n =50)(n =54)(n =173)(n =118)
(n =12)
TCGA samples
lisa多高D
图1分析UBE2S 在肝癌中的表达差异
Fig.1Analysis of UBE2S expression in LIHC.A ,B :mRNA expression of UBE2S in unpaired and paired samples.C :Protein expression of UBE2S in tumor and normal tissues in CPATC with UALCAN.D :Correlation of UBE2S expression level with tumor grade in TCGA with UALCAN.E :Promoter methylation levels of UBE2S in tumor and normal tissues in TCGA with UALCAN.F :Correlation of UBE2S expression levels and TP53mutation in HCC in TCGA with UALCAN.***P <0.001.
一次新鲜微球体培养基。培养1~2周后，显微镜下观察并计算肿瘤球数目。1.5统计学方法
运用SPSS22.0统计软件分析数据。细胞实均都分别进行3次独立重复实验，计量资料采用均数±标准差表示，两组比较用两样本t 检验，多组比较采用单因素方差分析。使用Kaplan-Meier 生存曲线评估UBE2S 高、低表达组的预后差异，统计分析基于log-rank 检验。以P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1鉴定肝癌中UBE2S 的表达特征
RNA-seq 数据库分析显示，UBE2S 的转录水平在肿瘤中升高（图1A 、B ，P <0.001）。UALCAN 数据库分析明确了UBE2S 蛋白在肿瘤组织中的高表达（图1C ）。UBE2S 的表达随着肿瘤分级的增加而逐渐升高（图1D ）。UBE2S 启动子区的甲基化水平低于正常组织（图1E ）；UBE2S 在TP53突变时的表达水平比正常组高（P <0.001，图1F ）。
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2.2鉴定肝癌中UBE2S 的预后特征
生存分析显示UBE2S 高表达组的患者预后更差（图2A~C ）。ROC 曲线分析UBE2S 的临床诊断价值，结果显示曲线下面积高达0.946（图2D ）。
图2探究UBE2S 在肝癌中的预后意义
Fig.2Prognostic value of UBE2S for LIHC.A :Progression-free survival curves of the patients.B :Overall survival curves of the patients.C :Disease-specific survival curves of the patients.D :ROC curve.
S u r v i v a l p r o b a b i l i t y
1.0
0.80.60.40.20.0
306090
120
Survival (month)
P <0.001
P <0.001
P <0.001
S u r v i v a l p r o b a b i l i t y
1.0
0.80.60.40.20.0S u r v i v a l p r o b a b i l i t y
1.00.8
0.60.40.20.0
306090120
Survival (month)
306090120
Survival (month)
S e n s i t i v i t y (T P R )
1.0
0.8
0.60.40.20.00.0
0.20.40.60.8 1.0
1-Specificity (FPR)
C
A B D 2.3单细胞测序显示UBE2S 在增殖性T 细胞中特异性高表达
分析单细胞数据GSE166635中UBE2S 在肝癌组织微环境的各细胞类中表达水平。结果显示，经过对数据的降维聚类处理之后，共得到21个不同的细胞clusters （图3A ）。用于注释细胞类型的细胞markers 如图3B 。在11个不同的细胞类型，上皮细胞比例最高（图3C 、D ）。UBE2S 在Tprolif 细胞中表达丰度相对较高（图4）。
2.4单细胞测序揭示细胞间通讯
在肝癌中Epithelial 之间、和Fibroblasts 以及和Endothelial 的交互强度强于其他种类的细胞（图5A ）。Tprolif 细胞与其他细胞之间的交互强度相对不活跃（图5B 、C ）。
2.5单细胞测序揭示调控各种细胞的转录因子
CEBPB 、SMAD1、SPI1、IRF1、JMJD1C 、CEBPA 和STAT1可以调控Tprolif 细胞的状态（图6A ）；在
Tprolif_C12中，最显著的转录因子是SPI1；在
Tprolif_C18中，最显著的转录因子是FOXM1（图6B 、C ）。2.6UBE2S 肝癌组织高表达
免疫组化结果显示，UBE2S 确实高表达于肝癌组织（图7A ）；多免疫荧光结果显示，UBE2S 在肝癌组织中的肝癌细胞和T 细胞中均有较高的表达（图7B ）。2.7敲低UBE2S 可降低肝癌细胞的干性
免疫印迹分析结果显示，在转染shUBE2S 的HCC 中UBE2S 蛋白表达水平降低（shUBE2S-1，P <0.01、P <0.05；shUBE2S-2，P <0.01、P <0.01，图8A ）。克隆形成实验结果显示，UBE2S 敲低组HCC 细胞克隆形成数与对照组相比减少（shUBE2S-1，P <0.05、P <0.01；shUBE2S-2，P <0.01、P <0.05，图8B ）。悬浮成球实验结果显示，UBE2S 敲低组HCC 细胞形成肿瘤球的数目与对照组相比减少（shUBE2S-1，P <0.05、P <0.01；shUBE2S-2，P <0.01、P <0.01，图8C ）。
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3讨论
UBE2S 是泛素化过程所需的泛素结合酶E2家族的成员之一，可以促进蛋白结合泛素分子，参与细胞信
号转导和调节细胞分裂周期等病理生理过程［18-20］
。关于UBE2S 在肝癌中的作用有部分文献报道，其高表达于肿瘤微环境的各种免疫细胞，但局限于生物信息学分析，未进行实验确认；生物信息学分析依赖于高通量数据，数据质量多种因素的影响，可能会有偏差，需要进一
步实验验证以明确生物学意义［21,22］
。UBE2S 可以用作各种肿瘤的标志物；如UBE2S 在
乳腺癌和宫颈癌的表达水平更高，并与预后不良有关［23,24］。通过数据库挖掘分析和多重验证，本研究发现UBE2S 表达水平与HCC 的进展密切相关。从表观遗传学的角度分析，启动子区甲基化水平与该基因的转录水平呈现负相关。我们发现UBE2S 的DNA 启动子甲基化在肿瘤组织中显著的下调，这与肿瘤组织中转录水平增加是统一的。UBE2S 在HCC 中高度表达，并与HCC 患者相关癌症预后不良是相关的，这为进一步研
A
LIHC_GSE166635
图3单细胞测序分析肝癌中各细胞类型及比例
Fig.3Single-cell sequencing analysis of the types and proportions of different cells in LIHC.A :UMAP diagram showing 21different cell clusters.B :Cell marker plot showing cell markers for annotating cell types and their expression levels.C :UMAP diagram showing 11different cell types annotated.D ,E :Proportion and number of different types of
cells.
C
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D
B
E
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