罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。
试剂盒组成：
小瓶/盖子 | 标签 | 内容物 |
1 蓝 | 酶溶液 | 大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶，在storage buffer中 10×conc. 5×50ul |
2 紫 | 标记溶液 | 在reaction buffer中的核苷酸混合物 1×conc. 5×550ul |
3 黄 | 转化-POD | 抗荧光素抗体，绵羊Fab片段，连接有辣根过氧化物酶 Ready-to-use 3.5ml |
需要自己配置的其他物品：
除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览：
步骤 | 设备 | 试剂 |
样品准备section 3.2 | ||
黏附细胞，细胞涂片和细胞离心涂片准备 section3.2.1 冰冻组织section3.2.2.2 | Washing buffer：磷酸缓冲液PBS* Bloking buffer封闭缓冲液：溶于甲醇的3%H2O2 Fixation solution固定剂：溶于PBS的4%多聚甲醛，ph7.4，新鲜配制 Permeabilisation solution渗透溶液：溶于0.1%柠檬酸钠的0.1%Triton X-100，新鲜配制（6） 固定剂 | |
石蜡包埋组织 section3.2.2.1 | 二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中） Washing buffer：PBS* 蛋白酶K*，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL中，ph7.4-8] 替代处理方案 ※渗透溶液：（0.1%Triton1） X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制 ※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，0.01N HCL，不含核酸酶 ※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射 | |
标记步骤 section3.3 | ||
阳性对照 section3.3.1 | 微球菌核酸酶或 DNase I，重组，级别1* | |
黏附细胞，细胞涂片和细胞离心涂片和组织 section3.3.2 | Parafilm石蜡封口膜或盖片 湿盒 | Washing buffer：PBS* |
Difficult tissue 困难组织 | 塑料容器 微波 湿盒 | Citrate buffer柠檬酸盐缓冲液，0.1M，ph6.0 Washing buffer：PBS* Tris-HCL，0.1M ph7.5，含3%的BSA*和20%正常牛血清 |
信号转换 section3.4 | ||
湿盒 Parafilm石蜡封口膜或盖片 | Washing buffer：PBS* DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB金属增强底物*或POD底物替代物 光镜镜检封固剂 | |
产品概述：
特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂
实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。两种情况均能产生假阴性。
假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段
DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查
凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数
样本：细胞离心涂片和细胞涂片
在chamber slides上培养的黏附细胞
冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本
分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透
检测次数：一个试剂盒50T
试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。
试剂 | 储存和稳定性 |
TUNEL反应混合物 | TUNEL反应混合物应在用前临时配制，不能储存 TUNEL反应混合物用前应置于冰上 |
转化-POD | 一旦融化转化-POD溶液后，应储存于2-8℃（最长稳定6个月） 注意：禁止冰冻结冰 |
优点：
优点 | 特点 |
灵敏 | 在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断 |
特异 | 对坏死来说，优先标记凋亡 |
快速 | 分析时间短（2-3h） |
简便 | 试剂稳定、优化，没有稀释步骤 |
灵活 | 适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本 双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段 |
Function-tested功能检查 | 对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测 |
步骤和所需材料：
1 流程图：
2 样品准备
2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片
需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）
Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2
Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制
Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton1）X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制
步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
注意：固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照
步骤 | 操作 |
1 | 用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本，1h，15-25℃ |
2 | 用PBS冲洗玻片 |
3 | 用封闭液孵育，10min，15-25℃ |
4 | 用PBS冲洗玻片 |
5 | 用渗透液孵育，2min，置于冰上2-8℃ |
6 | 按3.3操作 |
2.2 组织部分
2.2.1 福尔马林-包埋组织
福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓度、孵育时间和温度应按组织类型优化
注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸酶，核酸酶可导致假阳性。
另外3中替代方法在下表中描述（step 2）
需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）
Washing buffer：PBS
蛋白酶K，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL中，ph7.4-8]
替代处理方案
※渗透溶液：0.1%Triton1）X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制
※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，0.01N HCL，不含核酸酶
※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射
步骤：下表描述了用蛋白酶K（不含核酸酶）和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法
注意：加入额外的组织用于阴性和阳性对照
步骤 | 操作 | ||||||||||
1 | 按照标准操作脱蜡和再水化组织（e.g. 60℃加热，二甲苯浸洗，一系列梯度酒精和双蒸水再水化 | ||||||||||
2 | 用蛋白酶K工作液于21-37℃中孵育15-30min
| ||||||||||
3 | 用PBS冲洗两次 | ||||||||||
4 | 按3.3操作 | ||||||||||
2.2.2 冰冻组织处理（略）
3 标记草案
3.1 开始之前
准备TUNEL反应混合液：每一对管子（小瓶1：酶溶液，小瓶2：标记溶液）足以用于50ul反应体系的10张片子，和2个50ul标记溶液的阴性对照。
注意：TUNEL反应混合液应于用前临时配制，不能储存。TUNEL反应混合液用前置于冰上
步骤 | 操作 |
1 | 取100ul标记溶液（小瓶2）用于阴性对照 |
2 | 加入总量50ul的酶溶液（小瓶1）于450ul的标记溶液中，以获得500 ul TUNEL反应混合液 |
3 | 充分混匀 |
需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或
DNase I，重组，级别1*
对照：每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应
阴性对照 | 孵育固定和渗透的细胞于50ul/标记溶液中（无末端转移酶），替代用TUNEL反应混合液孵育 |
阳性对照 | 孵育固定和渗透的细胞于微球菌核酸酶或DNase I，重组，级别1中（3000U/ml-3U/ml 于50mM Tris-HCL中，ph7.5，10mM MgCL2，1mg/ml BSA）10min，15-25℃，以诱导在标记前DNA链断裂 |
3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案
需准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
步骤：参考下表
步骤 | 操作 |
1 lisa多高 | 用PBS冲洗两次 |
2 | 使样品周围区域变干 |
3 | 加入50ul TUNEL反应混合液于样品上 注意：阴性对照加入50ul标记溶液。确保TUNEL反应混合液均匀分布于单层细胞上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片 |
4 | 在湿盒、暗室中加盖孵育60min，37℃ |
5 | 用PBS冲洗3次 |
6 | 可在样品上加入1滴PBS，于荧光显微镜下观察。激发光波长450-500 nm，在515-565 nm（绿）范围类检测 |
3.3 困难组织标记草案（略）
3.4 信号转换
需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
DABA底物或POD替代底物
光镜镜检封固剂
步骤：按照下表操作
步骤 | 操作 |
1 | 使样品周围区域变干 |
2 | 加入50 ul 转化-POD（小瓶3）于样品上 注意：确保转化-POD溶液均匀分布于单层细胞上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片 |
3 | 在湿盒中孵育30min，37℃ |
4 | 用PBS冲洗3次 |
5 | 加入50-100ul DAB底物或POD替代底物 |
6 | 于15-25℃孵育10min |
7 | 用PBS冲洗3次 |
8 | 用玻璃盖片封固（e.g. 用PBS/甘油），光镜下检查 替代方法：光镜检查前可复染 |
4. 附件：
4.1 Troubleshooting
问题 | 步骤/试剂 | 可能原因 | 建议 |
非特异性标记 | 包埋组织 | 紫外辐射用于包埋组织的聚合（e.g.异丁烯酸盐导致DNA链断裂） | 使用不同的包埋材料或不用的聚合试剂 |
固定 | 酸性固定剂（e.g. 甲安菲他明，Carnoy’s 固定剂） | 使用4%多聚甲醛 使用福尔马林或戊二醛 | |
TUNEL反应 | TdT浓度太高 | 用TUNEL 稀释缓冲液1:2至1:10 稀释TdT浓度 | |
转化步骤 | 内源性POD活性 | 细胞渗透前，浸入3% H2O2甲醇稀释液10min，封闭内源性POD | |
抗-银光素-POD非特异性连接 | 用正常抗绵羊血清封闭 用含3% BSA的PBS封闭20min 减少转化溶液浓度50% | ||
核酸酶 | 某些组织（e.g. 平滑肌，组织准备后很快出现DNA断裂） | 取得器官后立即固定组织 通过肝静脉灌注固定剂 | |
某些酶仍有活性 | 用含有ddUTP和dATP的溶液封闭 | ||
背景高 | 固定 | 福尔马林固定导致含有黑素前体的细胞黄染 | 使用甲醇固定，但同时应考虑甲醇固定可能降低灵敏度 |
TUNEL反应 | 对于乳腺癌，标记混合物浓度太高 | 用TUNEL稀释缓冲液使标记混合物浓度降低50% | |
转化步骤 | 内源性POD活性 | 细胞渗透前，浸入3% H2O2甲醇稀释液10min，封闭内源性POD | |
抗-银光素-POD非特异性连接 | 用正常抗绵羊血清封闭 用含3% BSA的PBS封闭20min 减少转化溶液浓度50% | ||
样品 | 支原体污染 | 支原体检测试剂盒 | |
高增殖细胞 | 双染，e.g.用Annexin-V-Fluos 注意：Measuring via microplate reader not possible because of too high background. | ||
发布评论