㊃论著㊃
D O I :10.3760/c m a .j
.i s s n .1673-436X.2014.11.009作者单位:100482北京,
海军总医院肿瘤科(吴姗珊㊁孙海文㊁李欣㊁孙涛);200043上海,
第二军医大学海医系(倪啸晓)通信作者：孙涛,E m a i l :d r S u n t a o 1@163.c o m
机制初探
吴姗珊 孙海文 倪啸晓 李欣 孙涛
ʌ摘要ɔ 目的 通过对平滑肌细胞进行地塞米松快速预处理，拟证实糖皮质激素(g l u c o c o r t i c o i d s ,G C )对气道平滑肌细胞内三磷酸肌醇(t r i s p h o s p
h a t e ,I P 3)和细胞内游离钙离子([C a 2+
]
i )浓度升高有快速抑制作用㊂方法 原代培养的大鼠气道平滑肌细胞，比较不同浓度地塞米松预处理后10m i n 与对照组之间游离钙上升情况的区别㊂利用离子交换层析液闪法和F u r a -2/AM 显微荧光检测技术，分别检测肌I P 3和[C a 2+
]i 在受到激动剂刺激后的浓度变化；同时设米非司酮(m i f e p r i s t o n e ,R U 486)及(c y
c l o h e x i m i
d
e ,C H X )对照组，排除基因组作用在该反应中的影响㊂结果 用G C 温浴大鼠气道平滑肌细胞10m i n ，能够明显降低刺激物引起的气道平滑肌细胞内I P 3和[C a 2+]i 峰值㊂以上反应均不能被R U 486和C H X 影响或者逆转㊂结论 G C 能够通过非基因组作用快速抑制刺激物引起的气道平滑肌的收缩反应，使细胞内I P 3和[C a 2+
]i 浓度降低㊂G C 对于气道平滑肌的收缩可能存在着快速抑制作用,
并且这一作用是通过非基因组机制实现的㊂
ʌ关键词ɔ 地塞米松;
气道平滑肌；三磷酸肌醇；胞内游离钙离子D e x e m i s o n e r a p i d i n h i b i t o r y e f f e c t a n d t h e p o s s i b l em e c h a n i s mo nc o n t r a c t i o no f a i r w a y s
m o o t hm u s c l e c e l l s W u S h a n s h a n *,S u n H a i w e n ,N iX i a o x i a o ,L iX i n ,S u n T a o .*
D e p a r t m e n to f O n c o l o g y ,N a v y
G e n e r a lH o s p i t a l ,B e i j i n g 1
00482,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a
u t h o r :S u nT a o ,E m a i l :d r S u n t a o 1@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b j
e c t i v e T o p r o v e g l u c o c o r t i c o i d s (G C )c a na
f f e c t t h ea i r w a y s m o o t h m u s c l ec e l l s c o n t r a c t i o nb y d e p r e a s e d t h e p e a k s o f i n o s i t o l t r i s p h o s p
h a t e (I P 3)a n d i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m ([C a 2+
孙涛]i )i n t h e c e l l s i n d u c e db y a g o n i s t d i r e c t l y r a p i d l y .M e t h o d s P r e t r e a t t h em i c e a i r w a y s m o o t hm u s c l e c e l l s b y
d e x a m e t h a s o n e (D e x )w i t h i n10m i n ,t e s t t h e p e a k so f I P 3a n d [C a 2+
]i i nt h ec e l l sb y t
r e a t e d w i t h a c e t y l c h o l i n e (A c h ).R e s u l t s W ef o u n d G Cs i g n i f i c a n t l y d
e c r e a s e dt h ea n d p e a k so
f I P 3a n d [C a 2+
]i e l e v a t i o n i n d u c e db y a g o n i s t .N e i t h e r t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r a n t a g o n i s tm i f e p r i s t o n e (R U 486)n o r t h e p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r c y c l o h e x i m i d e (C H X )c o u l d a l t e r t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f g
l u c o c o r t i c o i d s s t a t e d a b o v e .C o n c l u s i o n s O u rr e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tG Ce x e r tr a p i di n h i b i t o r y e f f e c t so na i r w a y s m o o t h m u s c l e .T h e s i g n a l c h a n g e s i n t h i s p r o c e s s t h a t r e s t r a i n t h e p e a s ko f [C a 2+
]im a y b e r e s p
o n s i b l e f o r t h e r a p i dn o n g e n o m i c i n h i b i t o r y e f f e c t s o fG C .ʌK e y w
o r d s ɔ D e x a m e t h a s o n e ;A i r w a y s m o o t h m u s c l e ;L i n o s i t o lt r i p h o s p h a t e ;I n t r a c e l l u l a rf r e e c a l c i u m
糖皮质激素(g
l u c o c o r t i c o i d s ,G C )除了调节免疫和炎症细胞的功能，对于气道平滑肌细胞本身的收缩功能也有直接调节作用㊂患者在支气管哮喘
(简称哮喘)急性发作时，给予G C 吸入,
往往在数分钟内就能迅速缓解气道阻塞的症状，气道的直径及通气能力快速恢复[
1]
㊂本实验检测了地塞米松(d e x a m e t h a s o n e ,D e x
)对于大鼠气道平滑肌细胞内三磷酸肌醇(i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e ,I P 3)和胞浆游离钙离子([C a 2+
]i )浓度短时间内(10m i n
)的影响，从而探讨G C 快速抑制气道平滑肌细胞收缩的可能机制㊂
1 实验方法
1.1 实验动物 实验S D 大鼠(180~220g
)购于第
二军医大学动物中心，均为雄性，饲养于22~26ħ的环境，控制湿度在55%左右,12h照明与黑暗交替，动物均自由摄食，实验前动物无干扰饲养一周㊂1.2实验分组 ①空白对照组：细胞不进行处理直接破碎，制备样本;②阳性对照组：乙酰胆碱(A c e t y l c h o l i n e,A c h)10-4m o l/L终浓度反应2m i n，不给D e x;③D e x处理组：提前10m i n加10-6㊁10-7㊁10-8m o l/L的G C;④米非司酮(m i f e p r i s t o n e, R u486)阻断组：给D e x前50m i n加10-5m o l/L的R U486;⑤R U486对照组：加R U486处理，不给D e x;⑥(C y c l o h e x i m i d e,C H X)阻断组：给D e x前50m i n加10-5m o l/L的C H X;⑦C H X对照组：加C H X处理，不给D e x㊂其中选取10-7m o l/L 的G C为阻断组D e x浓度㊂
1.3I P3浓度测定参照A m e r s h a m公司生产的
I P3试剂盒说明书进行检测㊂
1.4 F u r a-2/AM显微荧光检测技术检测胞浆游离钙离子浓度[C a2+]i采用H o l d e n等[2]的方法㊂F u r a-2/AM负载：超净台内，将原代培养平滑肌细胞的玻片移入自制小培养皿㊂1mm o l/L F u r a-2/ AM4μl,0.01m o l/LF-12720μl加入2m l培养液中，摇匀，每皿200μl,37ħ摇动负载60m i n㊂负载结束后，移除负载液,H E P E S缓冲液洗两次后加入180μl(或160μl)H
E P E S缓冲液置于显微镜载物台上㊂按照上述方法分组和给药㊂用f i l t e rw h e e l 使激发波长在340n m和380n m之间快速切换，发射波长为510n m，曝光时间300m s㊂实验中应用M e t a F l u o软件进行图像分析，记录340n m和380n m处荧光强度(F340n m㊁F380n m)及F340n m/F380n m比值(简称r a t i o值)㊂
1.5统计学处理所得数据用表示，统计学分析应用S P S S11.0软件，采用方差分析及t检验，组间差异用单因素方差分析(O n e W a y A N O V A)，显著差异者用S N K-q检验进行比较,P<0.05为差异有统计学意义㊂
2实验结果
2.1 D e x对细胞内I P3和[C a2+]i浓度上升有快速抑制作用实验显示,A c h能够使大鼠气道平滑肌细胞内I P3和[C a2+]i升高，给予不同浓度D e x预处理10m i n后再给与A c h刺激，其峰值与对照组比较显著降低(10-6m o l/L,P<0.01;10-7m o l/L, P<0.05),10-8m o l/L时，虽有下降趋势，但差异无统计学意义(表1)㊂
2.2 R U486和C H X对D e x抑制I P3和[C a2+]i 上升作用没有显著影响浓度10-6m o l/L的选择性G C核受体拮抗剂R U486温浴细胞60m i n，对于10-7m o l/L的D e x抑制I P3和[C a2+]i升高的作用没有明显影响(表2),10-5m o l/L蛋白合成的阻断剂C H X处理细胞，温浴60m i n，对于D e x抑制细胞内I P3和[C a2+]i升高的作用同样没有明显的影响(表3)，两者本身对[C a2+]i浓度亦无显著影响㊂
表1 D e x对A C h激发的胞内I P3
和[C a2+]i的影响(x-ʃs)
组别鼠数(只)I P3(p m o l/L)[C a2+]i(m o l/L)对照组1017.56ʃ6.330.89ʃ0.06 A C h+D e x(10-8)组1013.61ʃ6.840.85ʃ0.05 A C h+D e x(10-7)组1010.39ʃ5.27a0.77ʃ0.06a A C h+D e x(10-6)组106.95ʃ3.45b0.69ʃ0.04b
注:D e x：地塞米松;A c h：乙酰胆碱;I P3：三磷酸肌醇；与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01
表2 R U486对D e x抑制胞内I P3和[C a2+]i
升高作用的影响(x-ʃs)
组别鼠数(只)I P3(p m o l/L)[C a2+]i(m o l/L)对照组1018.13ʃ5.270.87ʃ0.05 A C h+R U486组1016.96ʃ6.100.86ʃ0.05 A C h+D e x组1011.35ʃ6.52a0.76ʃ0.06a A C h+D e x+R U486组1010.99ʃ7.31a0.77ʃ0.04a
注:R U486：米非司酮;D e x：地塞米松;I P3：三磷酸肌醇;A c h：乙酰胆碱；与对照组相比,a P<0.05
表3 C H X对D e x抑制胞内I P3和[C a2+]i
升高作用的影响(x-ʃs)
组别鼠数(只)I P3(p m o l/L)[C a2+]i(m o l/L)对照组1016.63ʃ6.740.86ʃ0.03 A C h+C H X组1017.73ʃ6.680.88ʃ0.05 A C h+D
e x组1011.77ʃ5.92a0.72ʃ0.03b A C h+D e x+C H X组1011.08ʃ6.30a0.75ʃ0.04a
注:C H X：;D e x：地塞米松;I P3：三磷酸肌醇;A c h：乙酰胆碱；与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01
3讨论
G C在体内是由肾上腺皮质束状带合成和分泌的一类甾体激素，其合成和分泌受促肾上腺皮质激素的调节㊂以往的研究认为，这些作用的实现通常需要数小时甚至数天的时间[3]㊂但是K e t c h e l l等[3]报道吸入氟替卡松能够快速缓解气道的局部过敏反应，吸入G C能够在10m i n内抑制豚鼠气道平滑肌的收缩，减轻免疫反应引起的气道阻塞，维持呼吸的潮气量和肺顺应性，但是机制不清楚㊂肖林等[4]认为，这些作用是通过G C的非基因组效应实现的㊂气道平滑肌是气道壁的重要组成部分，是气道各组成成分中伸缩性最强的组织类型，对于气道直径的调节起着重要的作用㊂气道平滑肌的收缩过度，是哮喘急性发作时，造成气道管径急剧减小甚至某些小气道的闭塞，引起严重的呼吸困难[5]㊂气道
平滑肌的收缩状态和平滑肌细胞内的[C a2+]i浓度关系密切，诱发细胞收缩的激动剂与其相应受体结合后，通过G蛋白激活磷脂酶C，后者水解磷脂酰肌醇二磷酸生成I P3和甘油二酯,I P3激活肌浆网上的I P3受体，肌浆网C a2+释放增多,C a2+与钙调节蛋白结合后，激活肌球蛋白轻链激酶，肌球蛋白A T P酶活性增加，肌丝滑行，最终引起平滑肌收缩[6]㊂
本实验显示预先用D e x温浴大鼠平滑肌细胞10m i n后，再用A c h激动细胞，细胞内I P3水平与对照组比较显著降低(10-6m o l/L,P<0.01; 10-7m o l/L,P<0.05)，相应的[C a2+]i水平也受到抑制，尤其在D e x浓度高时更加明显㊂
由于I P3诱导的[C a2+]i水平上升对于平滑肌细胞的收缩强度起着决定性的作用[7]，故较低的[C a2+]i水平预示着平滑肌细胞的收缩强度减弱，如果气道内多数平滑肌细胞的收缩强度均减弱，气道痉挛的程度就会减轻，气道内径有所增大，通气能力将会改善㊂这可能也是G C吸入时能够快速缓解哮喘症状的机制之一[8]㊂由于本实验G C预处理时间较短，远低于传统上认为的基因组效应所需要的时间[9]，并且本实验设置了激素受体阻断剂R U486对照组及蛋白合成阻断剂C H X组，证明阻断G C受体或阻断蛋白合成均不能影响D e x抑制平滑肌细胞内I P3和[C a2+]i的升高㊂进一步证明，该反应过程无需核内G C受体参与，亦无蛋白合成，本反应是通过非基因组机制实现的㊂
本实验中，肌球蛋白轻链激酶激活途径中I P3上游的任一信号分子活性或数量的减少均能导致上述的结果，但D e x是通过哪种机制或信号分子实现这一过程仍不清楚，需要进一步研究㊂
综合上述的实验结果，我们认为,D e x快速抑制气道平滑肌[C a2+]i浓度是通过非基因组机制实现的㊂[C a2+]i的浓度降低，部分抑制细胞收缩肌球蛋白轻链激酶通路，从而抑制细胞的收缩㊂G C对气道平滑肌细胞收缩功能具有快速非基因组抑制作用，为G C在哮喘中(尤其是急性发作时的吸入)的作用机制提供了新的理论依据㊂该作用机制的阐明为临床新药开发提供了新的研究方向㊂
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(收稿日期:2013-10-04)
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